白藜蘆醇對上皮細胞氧化應激保護作用的研究進展

郭 祺 孫維克 高 艷

1.濱州醫學院口腔醫學院，山東煙臺 264003；2.濱州醫學院附屬醫院兒童口腔科，山東濱州 256603

白藜蘆醇（resveratrol，RES），即 3，5，4’- 三羥基反式二苯乙烯，分子式為C14H12O3，因其最早于1940年分離自白藜蘆的根莖而得名，是廣泛存在于葡萄、大豆、花生等多種植物中的一種天然多酚化合物類抗毒素，當植物受到外部侵害或有感染威脅時其生成量明顯上升。RES具有包括抗氧化應激（oxidative stress，OS）在內的多種的生物學活性。OS是廣泛存在于多種疾病中的一種病理狀態，會導致細胞和組織功能受損。由于上皮細胞具有屏障、分泌、吸收等作用，上皮細胞OS在各類急、慢性疾病的發生發展過程中具有重要意義。

1 上皮細胞OS的機制及影響

上皮細胞是位于皮膚及腔道表層的細胞，在防御各種病原體和抗原入侵等方面發揮屏障作用，同時在分泌、吸收等方面具有重要意義。活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是關鍵生物分子的強氧化劑，在生理條件下，過量的ROS等自由基通常被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶以及谷胱甘肽等非酶抗氧化劑清除，因此ROS會被維持在一定水平。OS是指體內氧化與抗氧化作用失衡導致氧化作用過強的一種狀態，是自由基在體內產生的一種負面影響。具體而言，OS的毒性作用能加劇細胞內脂類光氧化和脂質過氧化，這一過程會釋放有細胞毒性的羰基物質，影響脂質膜的流動性，破壞DNA和細胞蛋白質[1]。OS會抑制細胞自噬，導致胞內ROS和氮化物修飾分子的大量產生和積累，從而引發細胞器的損傷。過量的ROS或其他自由基還可以通過影響轉錄因子、黏附分子和氧化還原敏感的信號通路來干擾細胞正常生理活動，導致細胞和組織功能受損[2]。

2 RES抗OS作用概述

目前大量研究證實，RES主要是通過激活沉默信息調節因子1（silencing information regulator 1，SIRT1）對下游多種分子進行調控實現抗OS功能[3-6]。SIRT1屬于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的Sirtuin脫乙酰基酶家族，是能量平衡的中樞調節因子，能夠使組蛋白和轉錄因子去乙酰化，并調控多種代謝過程相關基因的表達，進而影響糖異生、脂肪酸氧化和線粒體功能。Liu等[5]指出，RES可提高SIRT1的表達并阻斷半胱氨酸蛋白酶和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶依賴的細胞凋亡途徑；減少細胞內ROS的產生，改善線粒體膜電位和形態；且SIRT1抑制劑阻斷了上述RES的保護作用。RES激活SIRT1可作用于內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、匯絲氨酸 /蘇氨酸激酶（Akt）、核因子紅系2相關因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor-2，Nrf2）、抗 氧 化 酶 系、p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）等靶基因、靶蛋白，進而對上皮細胞OS發揮調控功能。

3 RES激活SIRT1發揮OS作用機制

3.1 RES調控eNOS

eNOS作為一種重要的調節酶，發生磷酸化時即轉化為活性狀態，能催化內皮細胞中的氨基酸L-精氨酸產生具有血管舒張作用的一氧化氮（NO）。有研究發現，RES通過提高環磷酸腺苷（cAMP）水平增強蛋白激酶A活性，上調cAMP反應元件結合 蛋 白（cAMP-response element binding protein，CREB）磷酸化，誘導CREB介導的eNOS轉錄上調，這能減輕低密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞OS損害，并改善載脂蛋白E缺陷小鼠的內皮功能障礙[7]。Hannan等[8]證實，RES在減少可溶性fms樣酪氨酸激酶和可溶性內皮素的抗血管生成分子方面具有積極作用，可減少內皮素-1的分泌并提高eNOS的磷酸化水平。此研究還發現RES的會增加內皮細胞中血管細胞黏附分子這一內皮功能障礙標志物的表達，這一結果與RES改善內皮功能障礙的預期效應相悖，但導致此變化的機制及其潛在生物學效應尚有待探討。Toaldo等[9]通過對兩種細胞共培養和序貫培養體系中ROS和NO水平檢測發現，雖然RES及其硫酸鹽和葡萄糖醛酸代謝產物均強烈誘導NO的產生并顯著降低ROS水平，但在共培養體系中細胞之間存在明顯的串擾效應。綜上所述，RES可通過增加eNOS表達并提高其活性發揮抗OS作用，且此效應會受不同細胞間相互作用的影響。

3.2 RES調控蛋白激酶B（Akt）

Akt是可在磷酸肌醇3-激酶（phosphoInositide-3 Kinase，PI3K）調控下發生磷酸化而激活的一種蛋白激酶，能調節細胞生長、凋亡、黏附、遷移、浸潤和代謝。Cheang等[4]發現RES通過激活SIRT1表達，增強了過氧化物酶體增殖物激活受體δ（peroxisome proliferator-activated receptor-δ，PPARδ）的轉錄活性，改善了糖尿病和肥胖小鼠的血管內皮功能障礙。同時，有研究表明Akt的激活與PPARδ在血管系統中的作用有關[10]。但SIRT1-PPARδ-Akt是否是RES抗血管內皮細胞OS的潛在通路，以及SIRT1能否通過使PPARδ的某些賴氨酸殘基去乙酰化的直接效應來調節其功能有待進一步研究。

磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog gene，PTEN）蛋白可導致p-Akt去磷酸化而失活。Wang等[3]發現，RES激活的SIRT1與PTEN蛋白存在直接作用位點，且能抑制PTEN蛋白的表達，這有效避免了p-Akt的失活，從而激活SIRT1/PTEN/p-Akt通路，抑制肺泡上皮細胞OS。Fathalipour[11]指出，RES可激活PI3K/Akt信號通路，增加抗氧化酶SOD活性、防止細胞外調節蛋白激酶過度激活，抑制視網膜上皮細胞OS。而PI3K/Akt抑制劑可抑制RES的保護作用[12]。所以RES可能是通過調控Akt活性實現其抗OS功能的。

3.3 RES調控核轉錄因子紅系2相關因子（Nrf2）

Nrf2是屬于包含堿性亮氨酸區的轉錄因子的帽狀環家族的一種轉錄因子。細胞發生OS時，Nrf2由細胞質轉移至細胞核，與編碼多種解毒劑和抗氧化酶的抗氧化反應元件結合，并通過誘導抗氧化劑和2相解毒酶及相關蛋白的表達，對細胞氧化狀態發揮調節作用[13]。RES通過激活p62蛋白,介導Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）降解并誘導Nrf2及其下游抗氧化信號通路的表達[14]，改善細胞內丙二醛（malondialdehyde，MDA）和ROS的積累、減輕細胞凋亡等氧化損傷[15]。Zhuang等[16]證實，RES可提高多種抗氧化酶基因的表達，并上調Akt和Nrf2磷酸化；Nrf2 siRNA轉染阻斷Nrf2基因表達后，RES的保護作用消失；PI3K/Akt抑制劑可顯著抑制RES誘導的Nrf2磷酸化。Wang等[12]發現通過HO-1抑制劑或siRNA轉染阻斷HO-1基因表達后RES的抗OS作用消失。綜上所述，RES通過PI3K/Akt、Keap1和/或HO-1依賴性信號通路激活Nrf2發揮抗OS作用，Nrf2可能是連接上下游分子介導多條通路功能的關鍵節點。

3.4 RES調控抗氧化酶系

抗氧化酶系對ROS等關鍵生物分子的強氧化劑具有調控作用，可避免ROS或其他自由基影響轉錄因子和氧化還原敏感性信號通路對細胞功能的干擾。RES可有效改善順鉑誘導腎臟OS導致的谷胱甘肽過氧化物酶、SOD和CAT等內源性抗氧化酶活性降低；表現出與異硫氰酸芐酯相當的腎臟保護和抗氧化作用，且兩種藥物聯合使用的保護作用比單獨使用更強[17]。Singh等[18]發現RES通過恢復抗氧化劑（CAT、SOD、谷胱甘肽)活性，減少脂質過氧化。N-視黃亞甲基-N-視黃乙醇胺（A2E）是視網膜色素上皮（retinal pigment epithelial cells，RPE）細胞中脂褐素的主要成分，A2E光氧化生成單線態氧會產生ROS，而RES可減輕A2E誘導的RPE活力下降、凋亡、細胞單層完整性破壞等氧化損傷[19]。RES可提高SIRT1的表達并減少細胞內ROS的產生，且SIRT1抑制劑可阻斷RES的保護作用[5]。Yang等[20]發現RES通過恢復超氧化物歧化酶（SOD）活性并抑制MDA的活性，激活B細胞淋巴瘤-2基因表達，抵御過氧化氫誘導的RPE細胞氧化損傷。這些證據都證實RES能改善抗氧化酶活性，增強抗氧化防御系統，抵御脂質光氧化和過氧化。

3.5 RES調控p38 MAPK

p38 MAPK信號通路可調節細胞自噬這一負責異常蛋白質和受損細胞器降解和再循環的細胞溶酶體降解過程，該通路通過磷酸化激活，并與p38相互作用蛋白結合，在自噬體形成過程中調節某些蛋白活性。RES通過抑制p38 MAPK信號通路激活，促進p38蛋白的磷酸化和細胞自噬[21]，減少鎳誘導的細胞內ROS積累細胞凋亡[22]，從而抑制細胞氧化損傷。Pan等[23]證實RES能抑制細胞內腫瘤壞死因子-α誘導的CD40表達和ROS生成增加，促進SIRT1的表達，抑制p65和磷酸化p38 MAPK的水平。通過SIRT1抑制劑或siRNA轉染抑制SIRT1表達可有效阻斷RES的保護作用，且p38 MAPK抑制劑的作用與RES相似。綜上所述，p38 MAPK信號通路可能是RES激活SIRT1發揮抗OS作用的一個重要下游節點。

3.6 RES的其他潛在作用機制

Zhang等[24]證實RES降低細胞內ROS水平和DNA氧化損傷，并抑制細胞凋亡。另一項關于RES與RPE細胞的實驗發現，RES能改善OS導致的DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMT）和SIRT1功能抑制，并降低長散布核元素-1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）甲基化水平，以恢復細胞活力[6]。而Maugeri等[25]發現，HG誘導的OS上調RPE細胞DNMT功能，但不影響Line-1甲基化。這表明視網膜上皮細胞OS過程中可能表現出不同的DNA甲基化特征。由此可以推測，DNA去甲基化可能只是RES激活SIRT1保護視網膜細胞OS損傷的結果之一，而非此過程的必要環節，但這一假設還有待進一步的證實。

4 小結

大量研究結果表明，RES對各類上皮細胞的OS具有保護作用，且這一過程依賴于激活SIRT1進而對其下游各種靶基因、靶蛋白實現調控作用，同時RES在不同類型細胞中的作用途徑可能存在一定差異。對RES抗OS作用的探討，以及對其具體作用機制的進一步研究，有助于為各類OS相關疾病的預防和治療提供思路以及理論依據。