非小細胞肺癌中循環腫瘤細胞基因檢測及免疫標志物研究進展

劉應通 李道俊

三峽大學第一臨床醫學院 湖北省宜昌市中心人民醫院腫瘤科，湖北宜昌 443003

2020年全球肺癌發病率約為11.4%，病死率為18.0%，已成為惡性腫瘤致死的首要原因[1]。在肺癌的分型中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數的85%[2]。對于肺癌的診斷，病理學相關檢查仍是金標準；然而，腫瘤活檢是侵入性操作，患者因獲取組織存在高風險，無法獲得腫瘤組織。此外，腫瘤具有時間及空間的異質性，在某一部位及某一時間段獲取的腫瘤組織上的信息并不能完全表征腫瘤的信息，故而腫瘤間和腫瘤內異質性對指導臨床決策帶來了挑戰。基于此，液體活檢目前正受到關注，因為它具有非侵入性、快速、實時應用等優點，其一系列的研究正在進行中。液體活檢指通過對血液樣品等非固體生物組織的采集，檢測生物標志物，完善腫瘤分子分型、為治療方案的制訂提供相關信息。目前，液體活檢的生物標志物主要包括循環腫瘤細胞（circulating tumour cells，CTC）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs，主要是外泌體）、循環無細胞RNA（cfRNA）。其中，CTC是液體活檢的重要組成部分[3]。CTC的概念由澳大利亞病理學家Ashworth在1869年第一次提出[4]，是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段。與傳統的影像學、內窺鏡檢查以及病理學診斷相比，可敏感地監測疾病的變化，迅速地評價某一治療方案的效果。通過血液循環擴散腫瘤細胞是癌癥轉移重要的中間步驟，當單個細胞或癌細胞團具備分離并遠離原發腫瘤、通過周圍組織遷移并進入淋巴系統和血液循環的能力時，腫瘤的轉移性就變得明顯，這些細胞即是CTC[5-6]。CTC上行轉錄組學及相關標記物的測定，可以提供轉移和復發的早期預警及療效監測，CTC測定能夠監測癌癥進展、復發及其治療反應等。本文對臨床中常見的NSCLC突變基因及免疫標志物在CTC中的表達及研究進行綜述。

1 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）

對于具有驅動基因陽性的晚期NSCLC患者而言，目前靶向治療為一線首選治療，在靶向治療之前，需通過基因檢測明確靶向位點突變，EGFR為NSCLC中最常見的突變靶點，約占NSCLC患者的33.3%[7]。EGFR檢測方法眾多，有檢測EGFR蛋白表達水平的免疫組織化學法，還有檢測EGFR基因突變的DNA直接測序法、聚合酶鏈反應等，而檢測樣本國內外目前推薦組織樣本，認為其檢測的敏感度和特異度比其他類型的樣本高，是EGFR檢測的金標準。對于無法獲取組織樣本或樣本量不夠的晚期NSCLC患者，CTC上行EGFR分析也成為了一種選擇。對CTC行單細胞全基因組測序目前已有相關研究完成，其中第一個全基因組分析發表于2012年，并發現在單個CTC中檢測到的單核苷酸變異（single nucleotide variants，SNV）具有高度異質性[8]，與藥物靶標（如EGFR）、耐藥性（PIK3CA）和表型轉變（TP53、RB1）相關的重要突變都可以在CTC中檢測到，從而揭示CTC基因組分析的重要臨床價值。對于CTC中的EGFR檢測，近年來也得到了進一步的研究。有研究[9]通過下一代測序對37個富含CTC的患者行EGFR分析，結果發現在檢查樣本中發現了EGFR突變，并且包含了所有目前臨床中常見的突變類型，通過進一步將CTC上的EGFR檢測分析與組織EGFR分析對比，發現CTC與組織中的EGFR突變率具有一致性，這一點在EGFR 19外顯子缺失突變中更為顯著。Turetta等[10]也通過ddPCR的方法檢測了CTC中EGFR突變情況，發現在85%的患者CTC中有著與組織基因檢測的一致性，并發現在組織檢測EGFR野生型的一部分患者也可以從CTC中檢出EGFR突變。盡管表皮生長因子受體的酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）為NSCLC患者帶來了巨大的臨床獲益，但其在治療過程中仍然會產生耐藥，T790M突變是EGFR-TKI耐藥的常見機制，因此對于EGFR-TKI耐藥的患者T790M的檢測變得至關重要，Sundaresan等[11]通過對40例EGFRTKI治療進展的EGFR突變的患者再次活檢組織的T790M基因型檢測及CTC的檢測進行了比較，發現在腫瘤活檢組織、CTC樣本和ctDNA樣本中成功獲得了T790M基因型，使用每種基因分型測定法在47%～50%的患者中檢測到耐藥相關突變，其一致性范圍為57%～74%。雖然基于CTC和ctDNA的基因分型在20%～30%的病例中存在差異，但對于多數患者，這兩種檢測方法的互補性使所有患者的基因分型、精準治療成為可能。

2 間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）

ALK基因突變是NSCLC患者中常見的另一個突變靶點，其突變率在1%～7%，并且有ALK基因突變的患者較少伴隨EGFR及KRAS基因的突變[12-15]。根據NCCN指南，對于ALK陽性的晚期NSCLC患者，一線推薦使用分子靶向藥物克唑替尼等ALK酪氨酸激酶抑制劑治療。對于ALK基因重排的檢測，目前最常用的是免疫熒光雜交技術（FISH），這種方法同樣具有異質性，小活檢標本與切除標本ALK基因重排的一致性并不一致。Ilie等[16]最先對CTC上ALK基因重排進行了分析，他們通過免疫組織化學染色，發現研究的46例患者中有5例肺腺癌患者ALK陽性，后續行FISH分析證實了具有ALK基因重排，在這5例患者中均檢測出了CTC，并且CTC-ALK呈陽性，在CTC中分析ALK基因重排的可行性，在后續的Tan等[17]的研究中也得到了證實。但是，FISH檢測ALK基因重排與CTC-ALK檢測重排并非具有完全一致性，少數經FISH檢測為ALK陰性的患者，其外周血CTC中ALK基因檢測具有突變[18]。CTC行ALK基因測序可以提供一種獨特的方法來評估患者突變情況，為部分無法獲取組織的患者提供了另一種基因檢測方法，可能有助于發現用藥療效及異質性耐藥的機制。

3 程序性死亡受體配體-1（programmed death receptor ligand-1，PD-L1）

免疫檢查點抑制劑為晚期NSCLC患者帶來了獲益，尤其是對于PD-L1高表達即腫瘤細胞陽性比例分數（tumor proportion score，TPS）≥ 50% 的患者，免疫檢查點抑制劑可顯著延長患者無疾病進展生存期（progression-free survival，PFS），且治療過程中總體不良反應發生率更低[19-20]，基于此，對于PD-L1高表達，驅動基因陰性的晚期NSCLC患者，因此將免疫檢查點抑制劑納入了一線治療。并且發現PD-L1的表達水平可作為免疫治療療效的預測因素，對于PD-L1的檢測，往往通過免疫組織化學的方法進行，對患者的組織樣本量要求較高，并且不便于多次取樣檢測、動態評估，而CTC-PD-L1的檢測便可克服此項困難。通過既往的研究，CTCPD-L1的表達分析具有可行性，Chen等[21]通過收集51例NSCLC患者外周血行CTC檢測并對CTC進行PD-L1分析，結果發現，有28例（67%）患者的CTC中可見PD-L1表達，這項研究同時對患者的組織通過22C3抗體行PD-L1免疫組織化學染色，通過與CTC-PD-L1對比，兩者之間具有80%的一致性。然而這項研究并未對CTC-PD-L1進行動態檢測，并且納入的患者基線特征并不統一。Guibert等[22]納入了96例晚期NSCLC患者，并在納武利尤單抗治療前和進展時收集血液樣本，在CTC上動態評估PD-L1的表達水平，結果發現，在基線時，便在大部分患者的CTC中檢測出了PD-L1的表達，通過后續使用納武利尤單抗治療進展之后行CTC-PD-L1分析，發現治療前CTC高負荷與預后不良相關，但PD-L1在CTC上的表達沒有顯著的預后影響。與Chen等[21]的研究一樣，這項研究也進行了組織PD-L1的檢測，不同于Chen等的研究，其CTC-PD-L1與組織PD-L1之間的一致性僅為45.4%，兩者之間并沒有統計學差異。在前幾項的研究中，行CTC檢測均使用的是患者的外周靜脈血，Dong等[23]則采取患者的外周動脈血及肺靜脈血行CTC及CTC-PD-L1分析，結果發現肺靜脈血中CTC的檢測陽性率顯著高于外周靜脈血，并且肺靜脈抽血的方法可能會提高PD-L1在CTC中的檢測效率。綜上所述，CTC-PD-L1檢測具有可行性，但是其檢測結果與組織學PD-L1檢測結果之間的一致性仍待商榷，并且目前CTC及PD-L1的檢測方法并沒有統一的標準，所以CTC-PD-L1為免疫治療的預后指標仍需大型的臨床試驗進一步佐證。

4 腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）

TMB可能是免疫治療（ICS）療效的另一個預測因素，CheckMate 026試驗在一線NSCLC治療中比較了PD-L1≥5%的患者納武利尤單抗組與化療組療效及安全性分析，在基于TMB的探索性亞組分析中，與化療相比，在TMB高的腫瘤中，納武利尤單抗報告了更高的客觀緩解率（objective response rate，ORR）和更長的 PFS[24]。同樣，TMB被用作PFS的前瞻性生物標志物，作為CheckMate 227研究中的兩個共同主要終點之一，該研究將納武利尤單抗和伊匹木單抗的組合與鉑類化療進行了比較。在基于組織活檢的TMB高的患者組中（tTMB，定義為每兆堿基≥10個突變），其PFS及ORR較化療組相比具有顯著獲益[25]。目前尚不清楚在CTC中行TMB的檢測是否與ICI的臨床結果相關。但是，既往的研究已經評估來了血液TMB（bTMB）在晚期NSCLC中的預測價值的研究。據報道，由NGS確定的bTMB與使用全外顯子組測序的tTMB相關[26-27]。在對POPLAR和OAK臨床研究的回顧性探索性分析中，證明了具有高bTMB（≥16 Mut/Mb）的患者與更好的結果預后相關[28]。目前給予血液的TMB檢測已有多項臨床試驗正在開展，但CTC中的TMB檢測需要進一步研究，CTC或將成為TMB研究的新焦點，因為它們允許對腫瘤表型進行結構評估和分子表征。

5 總結

CTC的發現極大地改變了傳統的醫學模式，其標本采集方便、可動態檢測極大地方便了臨床，目前CTC可用于早期疾病檢測、預后、復發監測和個性化癌癥治療。CTC單細胞測序及免疫標志物的測定可以獲得癌癥患者CTC全基因組拷貝數變化規律及免疫標志物的轉歸情況，為我們鑒定癌種亞型，進一步揭示腫瘤轉移和克隆起源的分子機制。此外，CTC的單細胞測序能夠識別癌基因中的點突變，揭示接受癌癥治療的患者基因突變的動態變化，并預測耐藥性和表型轉化，最終提供真正個性化的醫療方法。液體活檢和無創分析無疑將繼續在NSCLC患者的整體評估和治療中發揮重要作用。但CTC行單細胞基因測序即免疫標志物檢測與臨床現在常用的組織檢測結果并不完全一致，兩者誰更能代表腫瘤的特性目前并無統一的定論。需要進一步的大樣本研究，CTC上動態監測基因靶向位點突變情況及免疫標志物的變化有望成為NSCLC診斷和治療中不可或缺的常規評估方法。