Nrf2抑制氧化應激對放射性組織纖維化的作用研究進展

郎家嬋 張霓霓 黃桂林 龍遠鑄

目前,放射治療(放療)是各種癌癥的主要治療方法,大約有50%以上的癌癥患者需要單獨或與手術、化療、免疫治療等結合放射方法治療[1]。然而,多達95%的放療患者可能會因為暴露于放射而給正常組織帶來短期和長期的不良反應[2]。放射性組織纖維化是放療的長期不良反應,嚴重威脅到肺、心臟、皮膚、腸道以及唾液腺等。另外,組織纖維化還降低了抗癌藥物在放化療和免疫治療中對腫瘤微環境的滲透[3]。放射誘導產生的過量自由基和活性氧類物質(ROS)引起氧化應激反應,在炎癥和纖維化介質的上調中起關鍵作用[4]。核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)通路在細胞氧化還原穩態和激活該途徑是對抗氧化應激的主要防御機制之一[5]。Nrf2的激活將有助于中和放射產生的ROS,促進受損DNA的修復,減少氧化應激,從而保護細胞免受放射誘導的細胞毒性損害[6]。相關文獻報道,放射后的抗氧化治療顯著降低動物模型中的放射性組織纖維化[7]。近年來,已有大量研究報道Nrf2通過抑制ROS的產生和調節其他抗氧化因子的表達來發揮抗纖維化作用[8,9]。因此,Nrf2可能是預防放射性組織纖維化的有效因子。本文對近年來Nrf2在氧化應激和放射性組織損傷防治中的作用研究進行綜述。

1 氧化應激與放射性組織纖維化

放射性組織纖維化是放療的晚期效應,通常發生在放射治療后4～12個月,并持續數年[10],其機制類似于傷口慢性愈合過程的機制。最初的損傷引發導致炎癥的急性反應,隨后是成纖維細胞的募集和細胞外基質沉積的激活。放射性損傷由放射誘導的直接DNA損傷和間接機制引發,間接機制涉及電離輻射與水分子相互作用產生ROS和氮物質RNS[11]。后者在放射性組織纖維化中更為突出,ROS可以促進肌成纖維細胞的增殖,從而導致膠原蛋白和纖維蛋白在細胞外基質中沉積[12]。在正常生理代謝過程中,細胞內的ROS是線粒體中電子傳遞鏈(ETC)和細胞質區室中NADPH氧化酶家族的副產物,是調節許多細胞過程的重要信號分子,適度水平的ROS有益于細胞增殖和宿主防御[13]。電離輻射促進ETC的電子泄漏并破壞ROS的酶清除劑,例如抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽過氧化物1(GPX1)和超氧化物歧化酶2(SOD2),導致產生大量ROS[14]。過量的ROS或這些酶的缺乏會進一步加重氧化應激,ROS的氧化能力可以破壞細胞內DNA的合成和修復、線粒體功能和抗氧化酶[11],如果未能修復,這些損傷可能導致細胞突變并促進腫瘤惡化[15]。

由放射誘導的ROS的連續產生可以激活信號傳導途徑以產生導致組織損傷和纖維化的纖維化形成因子。已有動物模型顯示ROS對肺纖維化的形成和發展至關重要[16]。ROS可以介導TGF-β1的產生和活化,促進炎性因子和細胞因子的釋放,減少抗氧化防御,促進膠原沉積,表明ROS形成和降解的紊亂是常見纖維化途徑的關鍵部分[17]。低水平的ROS可以作為應激反應機制的激活劑,但放射誘導產生的過量ROS會導致內源性氧化還原動態平衡的破壞,通過誘導抗氧化酶作為Nrf2/ARE信號通路下游因子的基因表達清除過量的ROS[18]。與野生型成纖維細胞相比,Nrf2缺陷的成纖維細胞具有相對較高的活性氧基礎水平,在輻射暴露后5 d,ROS水平大大增加[19]。研究報道,鞘氨醇激酶抑制劑通過誘導Nrf2/ARE賦予放射抗性,激活抗氧化防御系統和DNA修復途徑來改善放射誘導的氧化應激和細胞毒性損傷[20]。

2 Nrf2及在各器官放射性組織纖維化中的作用

2.1 Nrf2及其生物學特性 Nrf2屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子家族的成員[21],與Nrf1和Nrf3一起,Nrf2屬于該轉錄因子家族的1個亞組。人類的Nrf2蛋白長605個氨基酸,包含7個高度保守的區域,即Neh1～Neh7[22]。Neh1在C端含有bZip序列,通過與細胞核內的Maf蛋白形成異二聚體[23]。Neh2是Nrf2主要的調控結構域,含有2個維持穩定性的ETGE和DLG基序結合位點以及7個主要負責泛素化的賴氨酸殘基[24]。Neh3位于Nrf2的C末端,具有高度保守性,與細胞的轉錄活性密切相關。Neh4和Neh5位于Neh1和Neh2之間,是反式激活結構域,它們與CREB結合蛋白協同結合并增強Nrf2的轉錄活性[25]。Neh6結構域在Nrf2中間含有大量的絲氨酸殘基,對Nrf2具有不依賴于Keap1的負性調控作用[26]。Neh7結構域通過與視黃酸X受體α(RXRa)直接相互作用抑制Nrf2轉錄活性[27]。

Nrf2通路調控超過500個基因的表達,其 游靶基因控制細胞抗氧化反應、細胞保護、編碼轉運蛋白以及解毒酶基因的表達[5]。Nrf2調控的抗氧化酶和解毒酶主要包括:谷氨酰胺半胱氨酸連接酶(GCL)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO-1)等[26,28]。Nrf2信號通路通過上調多種藥物代謝酶的表達來清除ROS,以此來發揮重要的抗氧化應激作用[28]。

Nrf2/Keap1/ARE通路是調控抗氧化因子最重要的內源性保護系統之一[21],廣泛參與氧化應激誘導的肺、心、腦、肝、腎和神經系統等組織損傷,可保護細胞蛋白和DNA免受ROS和親電試劑引起的氧化損傷。靜息狀態下,Nrf2與Keap1相偶聯,形成Keap1-Nrf2復合物,被Cullin3(Cul3)-Keap1泛素連接酶復合物快速泛素化,并通過蛋白酶體途徑降解,導致Nrf2無法進入細胞核發揮轉錄因子作用[24]。然而,在化學物質、親電子或氧化刺激的情況下,Keap1上的半膀氨酸殘基被化學修飾[21],特別是Cys151、Cys226、Cys273和Cys288,導致構象改變并削弱與Nrf2的相互作用,從而抑制Nrf2泛素化。Nrf2經歷了磷酸化并移位到細胞核[6],與ARE結合誘導抗氧化酶和第二階段解毒酶[29],提高機體抗氧化應激能力。在Nrf2基因缺失的小鼠細胞內的抗氧化保護基因以及Ⅱ相解毒酶表達顯著下降[30]。在衰老的人類成纖維細胞中,通過誘導劑刺激Nrf2介導的蛋白酶體激活,降低ROS水平和提高細胞在氧化應激后的存活率,以及延長壽命[31]。在早期階段,Nrf2維持氧化還原穩態并調節細胞生長以防止癌癥發生。然而,Nrf2的持續激活不僅可以抑制癌細胞凋亡,還可以促進癌癥干細胞的自我更新以及化療耐藥性[32]。

2.2 Nrf2在各器官放射性組織纖維化中的作用

2.2.1 肺部:放射性肺纖維化在治療后數月至數年的時間呈進行性發展,是不可逆轉的,可導致肺功能的永久性損害。當放射誘導的ROS和RNS的過量產生會觸發細胞氧化應激和炎癥,可破壞脂質、蛋白質、DNA,被認為是放射性肺纖維化中涉及的炎癥事件的關鍵起源[33]。Tian等[34]研究表明,敲除Nrf2基因的小鼠胸腔X射線照射后,血清中的抗炎因子白細胞介素IL-10和抗氧化蛋白酶水平降低,而促炎因子IL-6、干擾素-γ、腫瘤壞死因子等均水平升高,肺部炎性細胞浸潤增多,導致誘發肺部炎癥和急性肺損傷。研究報道,鐵死亡抑制劑liproxstatin-1通過激活Nrf2通路下調小鼠肺中TGF-β1、炎性因子水平,提高谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)和NQO1的表達,減少ROS損傷和緩解放射性肺纖維化[35]。Cao等[36]發現小鼠肺組織以及肺泡上皮細胞中Sirt3蛋白表達增加的同時,Nrf2的活性也顯著升高,最終放射性肺損傷的早期炎癥反應和晚期纖維化均得到明顯改善。在一項小鼠放射損傷模型實驗中[37],利用沙利度胺(THD)激活Nrf2,導致小鼠體內TGF-β/Smad3信號通路的抑制和放射性纖維化的減弱。而在Nrf2缺失的小鼠模型卻未觀察到THD的放射防護作用。孫萬良[38]發現表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)通過上調大鼠肺組織細胞內Nrf2、HO-1、NQO-1的表達水平,激活Nrf2/ARE信號通路,增加Ⅱ相解毒酶和下游抗氧化酶基因的表達,清除機體內氧自由基,抑制肌成纖維細胞的轉化和增殖,改善肺組織炎性反應和纖維化病變。Ebrahimpour等[39]研究表明,埃索美拉唑通過促進Nrf2核入位和誘導HO-1表達來控制促炎癥和促纖維化分子,進而發揮抗肺纖維化作用。Traver等[9]對小鼠進行12 Gy/d放射劑量,通過組織學評估顯示發現Nrf2缺失的小鼠對放射誘導的肺損傷敏感性是野生型小鼠的1.6倍,更易產生組織重塑和膠原沉積。該實驗研究證實Nrf2缺失使肺泡Ⅱ型細胞上皮-間充質細胞向肌成纖維細胞的轉變,增加了放射介導的肺組織重塑和膠原沉積,而上調Nrf2可增強肺內組織抗氧化能力,從而減輕放射誘導的氧化損傷和纖維化。綜上,Nrf2信號通路通過抑制氧化應激對放射性肺纖維化確實有保護作用。

2.2.2 肝臟:肝臟在受到放射線照射時會發生一系列生理、病理變化,從而限制放射治療療程或發展為嚴重的慢性副作用,如放射性肝纖維化。氧化應激是肝纖維化進展中的一個主要促纖維化因素[40],在很大程度上歸因于ROS的大量產生和抗氧化能力的減弱。Nrf2作為關鍵的抗氧化轉錄因子,通過促進多種抗氧化基因的表達來保護細胞免受氧化應激,在肝細胞中具有抗炎和細胞保護作用[41]。成纖維細胞生長因子10(FGF10)通過介導Nrf2激活促進肝臟中的抗氧化反應,有助于肝臟修復[42]。然而在Nrf2敲除小鼠中,FGF10過表達未能保護肝臟免受壞死、肝細胞凋亡和炎性反應。Liu等[43]在關于藻藍蛋白(PC)對小鼠放射肝損傷的保護作用實驗研究中,6 Gy全身X線照射導致小鼠肝臟組織發生了病理變化,與未加PC處理的小鼠相比,PC處理的小鼠組織學損傷明顯減輕。該實驗發現其作用機制是PC通過激活Nrf2/HO-1通路,提高Nrf2蛋白的表達,減少氧化應激,修復DNA損傷,從而減緩放射導致的肝組織損傷。桑椹素(MUL)通過改善TRIM31/Nrf2信號通路抑制NF-κB和NLRP3炎性小體的表達和釋放,緩解炎性反應和ROS的積累,有效阻斷肝星形細胞(HSCs)活化和抑制肝纖維化[8]。HO-1是Nrf2/ARE信號通路下游的重要抗氧化蛋白,其高表達可顯著降低多種炎性反應,有效緩解肝組織損害。Mamdouh等[44]在γ輻射大鼠誘導的肝損傷中,發現姜黃素通過增強激活Nrf2,調控Nrf2/HO-1信號通路改善促炎細胞因子的表達,抑制肝臟炎癥。YAP(Yes-associated protein)效應因子在肝臟保護、修復、再生和纖維化中的作用已被描述[45]。值得注意的是,在Nrf2缺乏的肝臟中激活YAP卻未能保護肝細胞免受炎癥損傷,導致廣泛的纖維化。以上研究結果都表明Nrf2的高表達可以對放射治療中的肝損傷具有肝保護作用,有效抑制肝纖維化的形成。

2.2.3 皮膚:皮膚作為放療進入機體的必經之路,皮膚會在第一時間受到射線的刺激。皮膚中的中性粒細胞被進一步刺激并釋放促炎細胞因子,使炎癥持續并增加ROS的形成,造成組織嚴重的氧化損傷和組織纖維化的形成,致使皮膚老化,甚至癌癥的發展[46]。故而,有效的抗氧化防御策略對皮膚也至關重要。Nrf2信號通路的內部或系統激活會產生級聯效應,是調節皮膚損傷或炎癥后抗氧化酶表達的核心角色,在皮膚穩態、修復中有著重要作用[26]。Knatko等[47]研究發現,在健康人體受試者中,局部使用含有Nrf2激活劑蘿卜硫素的提取物,可有效降低紫外線輻射引起的皮膚損傷,證明Nrf2的小分子激活物可以保護輻射誘導的損傷在細胞和體內。Xue等[48]在關于Nrf2調控GCH1對放射引起的細胞衰老程度影響的小鼠實驗中,發現與未照射小鼠組比較,照射組中細胞衰老程度明顯增加,同時過表達Nrf2組的陽性細胞數目明顯降低,起到緩解皮膚衰老的作用。Nrf2在保護皮膚細胞免受紫外線照射方面扮演著重要作用,如UVA誘導的細胞凋亡在Nrf2缺陷的小鼠皮膚成纖維細胞中強烈增強,然而Keap1敲除小鼠的成纖維細胞對UVA誘導的細胞凋亡只有部分保護作用[49]。在創面修復過程中,Nrf2表達活性增加可刺激上皮細胞的增殖和遷移,抑制細胞凋亡[50]。Wang等[51]在通過敲除Nrf2來研究蟲草素對成纖維細胞的影響放射性損傷皮膚實驗中,發現蟲草素以keap1依賴的方式激活Nrf2,增加Nrf2的入核表達來防止細胞衰老,提示蟲草素誘導的細胞衰老和抑制炎癥表達都是依賴Nrf2。研究發現,在含有蘿卜硫素治療的放射小鼠組中的纖維組織增生明顯少于對照組[52]。證實蘿卜硫素通過激活Nrf2的表達和功能,上調HO-1和CAT在內的抗氧化酶,抑制ROS的產生來阻斷NLRP3炎性小體的激活和DNA損傷,促進小鼠的放射性皮膚損傷修復。

2.2.4 唾液腺:放療是治療頭頸部癌最常用的手段之一。唾液腺由于自身特殊的解剖位置,常暴露于輻射區,便不可避免的出現唾液腺功能減退,如放射性唾液腺炎、口腔黏膜炎、放射性頜骨骨髓炎等,嚴重影響患者的生活質量。因此對放射性唾液腺的機制研究以及預防和保護唾液腺已成為重要的研究方向。Wati等[53]研究報道,通過Nrf2/Keap1信號通路的激活可減弱小鼠頜下腺中膠原沉積、免疫細胞浸潤、DNA損傷和凋亡,緩解氧化應激,改善纖維化的形成,提示Nrf2的激活對唾液腺具有抗衰老作用。Matsuoka等[54]研究證明,在口腔鱗狀細胞癌中,IL-6通過促進Nrf2信號通路抗氧化途徑的激活,進而增加抗氧化因子的表達水平,有效抑制放射誘導的細胞死亡以及控制癌細胞的抗輻射能力,從而提高患者生存率。張思琴等[55]在研究海帶多糖(LJP)對放射誘導下頜下腺氧化損傷的保護作用中,與對照組比較,給予LJP干預的放射小鼠組中頜下腺中的Nrf2,HO-1和NQO1蛋白含量進一步增加,提示LJP可能通過誘導激活Nrf2信號通路,增強其抗氧化能力,從而改善頜下腺組織的氧化應激損傷和炎性反應,有效減緩頜下腺放射組織的纖維化形成。

2.2.5 其他組織:慢性放射性腸炎的發病率為5%～55%[56],其主要特征表現為腸壁纖維化、腸黏膜萎縮、血管硬化及腸腔狹窄或穿孔等組織病變。原花青素B2在小鼠受放射腸道損傷后通過Nrf2/ARE信號通路抑制氧化應激促進腸道再生和修復[57]。研究報道,EGCG通過Nrf2信號通路清除ROS,激活Nrf2下游靶蛋白SIc7A11、HO-1和GPX4,抑制細胞凋亡和鐵細胞死亡,從而延長了照射小鼠的生存時間以及有效減緩了放射誘導的腸黏膜損傷[58]。Nrf2能夠與TGF-β相互作用,參與了包括腸道在內的許多器官的纖維生成過程[59]。Guan等[60]研究發現,用tBHQ處理小鼠慢性纖維結腸炎模型、以及用tBHQ或si-Nrf2預處理人腸成纖維細胞后,然后采用TGF-β1刺激轉化,通過檢測纖維化指標和細胞內ROS水平表明,tBHQ能通過抑制TGF-b1/SMADs信號通路進而減緩小鼠結腸炎和人腸成纖維細胞纖維化,而Nrf2缺失可促進TGF-β1誘導的腸成纖維細胞分化。其實驗結果表明,Nrf2在體內外均通過阻礙ROS/TGF-b1/SMADs通路來抑制腸纖維化。Seemann等[61]研究結果顯示,采用2.0、8.0 Gy的X射線對小鼠進行局部心臟放射后,可引起小鼠輕度延遲性心臟纖維化并降低毛細血管密度。橙花醇通過調節大鼠急性心臟毒性中的Nrf2/Keap1信號通路傳導,抑制炎癥介質和NF-κB/MAPK活化的改善,減輕氧化應激、炎癥和細胞凋亡[62]。已發現左旋肉堿通過激活p38MAPK/Nrf2信號通路誘導和NQO1的表達,抑制暴露于輻射心臟中活性氧的產生和細胞凋亡來減輕心臟功能的喪失[63]。研究報道,Ghrelin通過上調Nrf2,阻礙NADPH/ROS通路,從而抑制心肌梗死和血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞ECM重構和心肌纖維化[64]。丹參酮-I可以促進Nrf2從細胞質進入細胞核,進而激活下游通路,當Nrf2基因沉默表達后,顯示丹參酮-I失去對放射性膀胱損傷體外模型的保護性作用[65]。丹參酮-I通過介導Nrf2/ARE信號通路表達來提高膀胱組織內抗氧化應激損傷的能力,有效減緩放射性膀胱傷慢性期纖維化。

2.3 Nrf2激活劑 相關研究Nrf2轉錄因子的藥理學激活似乎是抑制各種組織和器官中與大量ROS產生相關的氧化應激的有效策略。多種化合物被報道在不同的細胞類型中激活Nrf2蛋白并刺激其靶基因的激活劑包括合成化合物以及常見于植物或食品中的天然分子。從中藥白術中提取的倍半萜單體白術烯內酯Ⅱ(ATR Ⅱ)通過激活Nrf2,上調下游靶基因HO-1和NQO1的表達,達到預防放射誘導損傷的作用[66]。白藜蘆醇是重要的抗氧化劑,可通過誘導激活Nrf2介導ARE下游抗氧化酶基因的表達,增強抗氧化酶SOD和GST的活性,對抗紫外輻射所致的氧化應激有一定的保護作用[67]。蘿卜硫素通過激活Nrf2介導的氧化應激和NLRP3/NF-κB炎性通路來保護胰腺腺泡細胞損傷[68]。表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是兒茶酚的主要組成成分,EGCG通過增加Nrf2的核入位,誘導Ⅱ相解毒酶抗氧化基因表達,增強抗氧化、炎性和抗纖維化活性,達到有效緩解放射誘導氧化應激損傷的作用[58]。白花紫露草的主要活性成分bracteanolide A可通過激活Nrf2及其下游保護蛋白酶NQO1和HO-1的表達來抑制細胞內ROS的產生,減輕氧化應激,降低炎性細胞因子的水平[69]。有文獻報道,丙戊酸鈉可以通過激活Nrf2/HO-1通路來減輕放射所致的腦損傷[70]。香葉醇是一種天然精油,在肝臟缺血再灌注前口服香葉醇的保肝作用是誘導Nrf2的激活以及HO-1表達的上調,抑制炎性介質和細胞凋亡,改善抗氧化防御系統并減少氧化應激[71]。除了這些化合物外,還有很多化合物都能影響Nrf2的轉錄和表達。總之,關于Nrf2的激活劑已成為預防和保護放射性損傷的研究重點,在醫學臨床治療中有著重要的應用價值。

Nrf2作為氧化應激防御最有效的效應物,對氧化還原基因的反式激活提供了抗氧化損傷的宿主防御機制,有助于增強細胞和組織的抗炎活性。