TDP-43 在缺血性腦卒中的作用

李釔朋，閆文靜，章帆，舒渝茜，何治*

(1 三峽大學國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室，宜昌 443002；2 三峽大學健康醫學院，宜昌443002)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中以缺血性腦卒中為主，約占腦卒中的85%[1]。缺血性腦卒中一般由主要的大腦動脈嚴重狹窄或栓塞所致，特定大腦區域血流不足，在短時間內出現不可逆的組織損傷，并伴有腦水腫的快速發展，嚴重威脅患者身體健康[2]。

目前，治療缺血性卒中的方法是溶栓治療，由于重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator, r-tPA）的治療窗口較窄（大約為缺血后3～4.5 h），且r-tPA 與腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷相關，導致其應用受限[3,4]。因此開發新的治療方法對于減少腦缺血所帶來的神經損傷至關重要。

反式激活應答DNA 結合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43, TDP-43）是一種參與轉錄抑制和選擇性剪接DNA 和RNA 的結合蛋白。TDP-43 在許多神經退行性疾病的中樞神經系統中，神經元和膠質細胞中的TDP-43 作為神經退行性疾病的病理學標記蛋白異常聚集和定位，可能成為治療缺血性卒中的潛在靶點[5]。本文將對TDP-43 的蛋白結構、分布以及生理功能進行概述，并綜述其TDP-在腦缺血發生發展中的作用。

1 TDP-43 的結構、分布與功能

TDP-43是一種由定位于人1號染色體Chrlp36.2上的TARDBP 基因編碼的DNA/RNA 結合蛋白，在進化上高度保守，包含414 個氨基酸，相對分子量約為43kDa[6]。TDP-43 蛋白在結構上屬于核內不均一核糖核蛋白細胞核因子家族，由一個N 末端、兩個RNA 結合基序（RNA recognition motif, RRM）以及一個富含甘氨酸的C 端序列構成。其N 端對維持TDP-43 的正常構象和生物活性具有重要作用[7]，由1 個核定位信號（nuclear localization signal, NLS）、3個Caspase-3 識別位點以及一個核輸出信號（nuclear export signal, NES）構成[8]。其中NES 和NLS 的突變是導致TDP-43 從胞核異常定位到胞質的主要原因。在應激條件下，TDP-43 蛋白還可被Caspase-3 切割為相對分子量為25kDa 和35kDa 大小的含C 末端的TDP-43 蛋白片段（C-terminal TDP-43 fragments,CTFs）。前者的異位表達導致細胞內TDP-43 包涵體形成，產生細胞毒性[9]。RRM 區域主要介導TDP-43與RNA 或者DNA 的結合[10]。TDP-43 蛋白C 端為甘氨酸富集區也被稱為類朊蛋白結構域, 介導蛋白質之間的相互作用，而且該序列易于形成聚集體并可導致細胞毒性[11]。

TDP-43 蛋白在生理條件下廣泛分布于人體和嚙齒類動物的胎盤、脊髓、脾、睪丸、卵巢、胰腺、肺以及腦的細胞核中，在病理條件下形成不溶性泛素包合物，使TDP-43 從細胞核向細胞質的重新分布[12, 13]。

TDP-43 是一種具有多功能的核酸結合蛋白，能夠通過多種途徑調控RNA 的代謝、轉錄、剪接和翻譯[14,15]。例如，研究發現，TDP-43 可通過調節神經元功能，在肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）、阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease, AD）、腦缺血等神經退行性疾病中扮演重要角色[16]。

2 TDP-43 在腦缺血中的作用

有研究表明，過表達TDP-43 的轉基因小鼠在短暫性腦缺血后，其梗塞的面積與正常小鼠相比更大、神經元死亡數量也顯著增加[17]。TDP-43 還參與缺血性腦卒中病理生理過程的系列反應，包括炎癥、細胞凋亡、血腦屏障功能障礙、自噬、線粒體功能障礙、以及氧化應激等[17-19]。

2.1 TDP-43 在腦缺血發生后表達水平的改變

正常情況下TDP-43 主要分布在細胞核中，在病理條件下它可在細胞核與細胞質之間穿梭，以執行多種細胞功能[20]。在疾病或者應激狀態下，病理性的TDP-43 可由基因突變以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修飾過程所導致，如在應激條件下，胞質TDP-43 與一些蛋白質和RNAs 形成應激顆粒，由細胞核到細胞質再分布和聚集體，細胞質中TDP-43聚集體的持續積累，導致細胞核內游離的TDP-43 減少，進而反應性地促進TDP-43 生成加劇，而細胞質中TDP-43 的增加又干擾了細胞器的正常功能，最終導致細胞死亡[16]。

在大鼠大腦中動脈缺血90 min 再灌注1 d 后，缺血核心區以及半暗帶全長的TDP-43 含量下降，但是分子量為25kDa 的TDP-43 的C 末端片段含量均升高。急性缺血性腦卒中后TDP-43 的亞細胞定位發生改變，可在胞質中檢測到全長的TDP-43 以及其25kDa 片段，但該片段不能在胞核中檢測到[21]。Kanazawa[21]等還發現，在急性缺血性腦卒中后，胞質TDP-43 再分布的神經元發生特異性泛素化，且呈現高比例細胞凋亡。在王錦[22]等研究中發現，大鼠缺血再灌注3 d 后， TDP-43 的表達急劇上升，大腦皮質、海馬以及紋狀體區域均出現聚集的顆粒樣包涵體，其中皮質區域最明顯，并且向細胞核外遷移，部分細胞的核周細胞質中也出現陽性反應物。

以上提示, 腦缺血的發生會誘導TDP-43 表達上調，并促進病理性TDP-43 聚集以及細胞質再分布，這種表達變化會進一步加重缺血性腦損傷。

2.2 TDP-43 參與腦缺血后炎癥反應

過度的炎癥和免疫反應是腦梗塞后缺血性腦損傷的病理生理基礎[23]，腦缺血后各種炎性因子、趨化因子以及轉錄因子的產生，會引起神經元不可逆的損傷[24,25]。腦缺血后小膠質細胞激活，促進細胞碎片的清除及神經營養因子的分泌，修復受損的組織，但是小膠質細胞過度激活而釋放的炎癥物質會抑制中樞神經系統的修復，造成神經元的損傷[26]。

有研究表明，TDP-43 過表達的神經膠質細胞應激后導致腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β 等促炎因子增多[27]。小鼠腦缺血再灌注損傷模型中TDP-43 的上調增強了核因子κB 蛋白（nuclear factor kappa-B,NF-κB）介導的炎癥和神經元損傷，而在給予NF-κB抑制劑后能有效改善TDP-43 所導致的神經元炎性損傷[17]。這提示TDP-43 過表達可促進炎癥反應的發生，損傷神經細胞，進一步加重缺血性腦損傷。

2.3 TDP-43 介導線粒體功能障礙

線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，它通過氧化磷酸化供給細胞能量[28]。卒中后神經元因缺血缺氧損傷線粒體，進而干擾磷酸化過程和三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）的供應導致神經元可塑性降低[29]，并且線粒體功能障礙還與腦缺血中氧化應激、凋亡等的發生機制密切相關[30]。TDP-43 的突變、過表達以及在線粒體中的異常積累會導致線粒體形態異常、功能障礙以及融合分裂動力學異常，從而損害細胞能量供應，最終導致神經元損傷[31]。

Wang 等[32]研究發現在TDP-43 轉基因小鼠中，細胞質中TDP-43 的異常定位導致其在線粒體的蓄積并引發線粒體功能障礙，而在使用一種TDP-43 線粒體定位抑制酶后，胞質中TDP-43 的異常聚集被清除，線粒體功能得以恢復，并且改善了轉基因小鼠的認知缺陷和運動協調。同時在體外實驗，糖氧剝奪/復氧復糖（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）的星形膠質細胞給予人參皂苷Rg1 后，線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ的活性增強，并提高了ATP 的水平。提示人參皂苷可能通過促進線粒體氧化磷酸化來改善線粒體功能，減輕OGD/R 之后星形膠質細胞的損傷[33]。

由此可以推斷，細胞質中TDP-43 的異常表達可引起線粒體功能障礙，減少能量供給，導致神經元細胞受損，加重腦缺血后腦損傷。

2.4 TDP-43 調節自噬

自噬是一種代謝機制，指細胞在自噬相關基因調控下通過溶酶體囊泡結構降解細胞內物質，這一過程能夠避免錯誤折疊蛋白質的積累[34]。有研究證實，受損的線粒體、蛋白質、以及過氧化物酶體和病原體可以通過自噬選擇性降解，從而保護細胞出現代謝應激防止細胞氧化損傷，而自噬對維持體內平衡至關重要[35,36]。

有研究表明，TDP-43 可通過增加自噬相關蛋白7、雷帕霉素靶蛋白相關調節蛋白和動力蛋白激活蛋白的穩定性來調節自噬。并且當TDP-43 濃度降低后，這些自噬相關蛋白mRNA 的濃度也明顯降低[19,37]。

在腦缺血損傷后，自噬對神經元起著雙重作用[38]。一方面，3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）可抑制自噬通路的激活，加劇神經元的凋亡和壞死，增加大鼠缺血缺氧所致的腦梗塞體積和神經功能損傷；另一方面在腦缺血前激活自噬通路可以增加蛋白激酶B（protein kinase B, PK）和環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein, CREB）的磷酸化，從而顯著減少神經元死亡和腦損傷[39]。然而在自噬阻斷劑3-MA 的干預下，突變型TDP-43 及TDP43-CTFs25、TDP43-CTFs35的表達水平均增高，從反面證實了突變型TDP-43 及其C 末端截短片段可通過自噬通路降解。因此，抑制缺血后自噬可以增加TDP-43 及其C 末端截短片段TDP43-CTFs25、TDP43-CTFs35 聚集物的加劇累積，增強細胞應激并誘導細胞死亡[40]。

2.5 TDP-43 促進細胞凋亡

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，在缺血時神經細胞凋亡是I/R 損傷最常見的形式之一[41]，可誘導產生氧自由基，導致細胞死亡。有研究表明，細胞凋亡會導致組織血流量減少，導致細胞發生形態、生化和行為變化等[42-44]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）為MAPK 家族蛋白的重要一員，介導對外界應激信號做出反應的基本生物過程，具有調節細胞轉移、凋亡、增殖和分化的作用，可以在各種應激刺激下激活，并通過作用于下游靶點，如轉錄因子以及抗凋亡蛋白B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）并介導其多種功能[45]。

有研究表明當JNK 通路被激活時，其下游凋亡相關靶基因的轉錄與表達受到調控，引發細胞的凋亡[46]。磷酸化的JNK（P-hosphorylation-c-Jun n-terminal kinase, p-JNK）作為JNK 的活性形式，有研究表明腦缺血后p-JNK 的表達增強，表明腦缺血能夠通過JNK 信號通路激活細胞凋亡途徑并介導神經元的損傷，引發神經退變的過程[30]。在神經元細胞中上調Ubiquilin-2 蛋白可以激活JNK 和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）增強NF-κB 活化使TDP-43 聚集[47]。另有報道，TDP-43 的過表達可以抑制JNK 和p38 的激活[48]。腦缺血后激活p-JNK 和磷酸化p38（P-hosphorylation-p38 MAPK, p-p38 MAPK）通路，使TDP-43 表達升高，而TDP-43 的過表達又反作用于p-JNK 和p-p38，降低其表達水平，使之呈現一種負反饋調節，最終加劇神經細胞死亡與神經退行性病變的發生[30]。

由此提示，TDP-43 可通過JNK 信號通路，加劇細胞凋亡，引起神經元凋亡和神經退行性病變的發生。

2.6 血腦屏障功能障礙

血腦屏障是由腦微血管內皮細胞和緊密連接蛋白、細胞外基質、神經元、周細胞以及星形膠質細胞等通過相互作用形成的一種動態屏障[49]。有研究表明，I/R 后血腦屏障被破壞，導致大量大分子、血細胞等進入腦實質進一步加重腦損傷引起神經功能損害[50]。

Yes 相關蛋白（YES-associated protein, YAP）作為Hippo 信號通路的轉錄激活因子可以促進血管內皮細胞的增殖、遷移和血管生成，調節緊密連接蛋白的生成與完整性[51-53]。腦血管內皮細胞的緊密連接蛋白，包括密封蛋白和閉合蛋白，是調節血腦屏障完整性和通透性的主要結構[54,55]。有研究表明，在小鼠MACO 模型和體外原代腦內皮細胞OGD/R 實驗中，沉默全長的TDP-43 或者過表達TDP43-CTFs35可導致細胞質中磷酸化的YAP（Phosphorylation YES-associated protein, p-YAP）與緊密連接蛋白含量降低，進而抑制血管內皮細胞遷移[56]。由此可以推斷，TDP-43 和TDP43-CTFs35 通過Hippo-YAP 信號通路來調節血管內皮細胞的功能，誘導腦內皮細胞緊密連接蛋白和p-YAP 的水平降低，抑制血管內皮細胞遷移導致血腦屏障功能障礙，阻礙腦缺血后神經元修復[56,57]。

3 TDP-43 在腦缺血相關疾病中的作用

TDP-43 除了通過介導炎癥、細胞凋亡、血腦屏障功能障礙、自噬、線粒體功能障礙、以及氧化應激等過程對缺血性腦卒中發揮神經保護作用外，還血管性癡呆、腦缺血后繼發性脊髓損傷等腦缺血相關疾病中發揮重要作用。

3.1 血管性癡呆

血管性癡呆是因大腦血流受阻而致腦細胞缺氧或缺少營養物質供給，最終導致患者出現認知功能障礙的一種疾病。缺血性腦卒中患者往往累及大腦微動脈和微循環，引起血管管壁增厚和管腔狹窄，甚至血管栓塞，血流阻力大，組織供血、供氧不足，導致神經元受損，出現認知功能障礙，促進血管性癡呆的發展[58]。

Thammisetty[59]等研究發現，當閉塞小鼠單側頸總動脈引起慢性腦缺血（chronic cerebral hypoperfusion, CCH）會誘導TDP-43 的胞質定位異常和不溶性磷酸化TDP-43 聚集物的形成，活化小膠質細胞，激活炎癥反應，使細胞代謝紊亂，神經元受損，進而發展成為認知缺陷和運動障礙。提示TDP-43 可以加重血管性癡呆并與血管性癡呆的發生發展密切相關。

3.2 腦缺血繼發性脊髓損傷

脊髓損傷是通過直接損傷脊髓實質和相關的脊髓神經造成感覺、運動功能障礙和肌張力異常等[60]。腦缺血后，由于皮質、海馬及紋狀體神經元受損，其向脊髓傳遞信號發生異常變化，致使脊髓中膠質細胞激活、炎性因子表達水平升高等繼發性神經炎性反應，可直接或間接地損傷前角運動神經元，加上前角運動神經元受上級神經直接調控的異常影響，進一步加深了神經元的損傷[16]。

孫瀟[16]等人發現，大鼠腦缺血后脊髓前角運動神經元中出現TDP-43 含量增加且出現從細胞核到細胞質異位的現象，三七皂苷Rg1 可以緩解腦缺血所致的脊髓繼發性神經退變和降低炎癥反應，進而對腦缺血所引起的脊髓損傷產生保護作用。

4 結語與展望

綜上所述，腦缺血的發生會導致TDP-43 表達以及結構和定位的變化，可能參與腦缺血損傷的病理生理過程, 包括氧化應激、血腦屏障功能障礙、細胞凋亡、線粒體功能障礙、自噬和炎癥等。有研究表明，通過降低TDP-43 的表達可以有效緩解腦缺血所致的神經損傷。關于具體哪種藥物可以降低TDP-43的表達研究相對較少，目前已有的報道僅有人參皂苷Rg1 和三七皂苷Rg1[16,30]。因此，TDP-43 作為一個潛在的靶點, 為缺血性中風的治療提供了新可能性，也為臨床新藥物的研發提供了理論依據。后續的研究重點應該集中于是否能將TDP-43 作為治療腦缺血的新靶點，尋找可以降低TDP-43 表達水平的具體物質。另一方面，也可以探討將TDP-43 作為標志物，開發新的關于腦缺血相關疾病的檢測手段。