野燕麥對精唑禾草靈的敏感性水平及其ACCase基因序列分析

王祥宇, 郝巧巧, 遠鑫洋, 劉潤強, 王洪亮, 張 佩,2

(1.河南科技學院資源與環境學院/河南省生物藥肥研發與協同應用工程研究中心,河南新鄉 453003;2.河南省博士后創新實踐基地,河南新鄉 453003)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

表1 2018—2021年所采集野燕麥種子信息Table 1 Population information of A. fatua collected in 2018-2021

1.1.2 主要儀器 PCR儀[耶拿分析儀器(北京)有限公司]、電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、電子天平(上海眾淵實業有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫療器械有限公司)、渦旋振蕩儀[艾卡(廣州)儀器設備有限公司]、GTR16-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司)、ASS-4 型自動控制農藥噴灑系統(北京盛恒天寶科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試種子信息 2018—2021年所采集的野燕麥種子信息見表1。

待野燕麥植株生長到1～2葉期時定苗,留20株/盆,繼續培養至2～3葉期,采用北京盛恒天寶科技有限公司生產的 ASS-4 型自動定量噴霧系統(扇形噴頭型號為TEEJET-9503EVS,噴霧塔為ASS-4型)進行莖葉噴霧處理。設定噴霧壓力為 0.275 MPa,噴液量為 450 L/hm2,噴液速度為 1.2 L/min,噴頭與植株之間的距離50 cm。根據預試驗確定各種群處理劑量,本試驗采用6個處理,分別為3.9、15.5、31.0、62.0、124.0、248.0 g a.i./hm2,每個處理4盆。另設清水作為空白對照(CK),在處理21 d后測定地上部莖葉的鮮重,計算每個野燕麥種群的鮮重抑制率,同時將藥劑處理后存活的單株葉片留存,每個處理重復4次共28盆,整體重復2次。

1.2.3 野燕麥的ACCase基因克隆及序列分析 待野燕麥生長到3～4葉期,剪取100 mg葉片,放入研缽中加入液氮研磨,提取方法根據DNA Quick Plant System[非離心柱型,天根生化科技(北京)有限公司]說明書進行。根據NCBI上已公布的與野燕麥同源性較高的大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)的ACCase 基因序列(登錄號:AJ310767)設計1對引物[8]:正向引物,3′-CTGAATGAAGAAGACTATGGTCG-5′;反向引物3′-TCCTCTGACCTGAACTTGATCTC-5′。

PCR擴增目的基因長度為1 050 bp,退火溫度為55 ℃,包括1 781～2 088氨基酸突變位點。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司負責合成。反應體系為25 μL,參數為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,35個循環;72 ℃ 10 min,電泳驗證結果,完成后將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序所得序列在 NCBI 上進行 BLAST 比對,用BioEdit軟件對擴增出的抗性與敏感野燕麥種群的ACCase基因序列進行比對,分析是否發生特定位點氨基酸突變。每個種群檢測10株植株。

1.2.4 數據處理及抗性分級 使用R軟件“drc”程序包中drm函數的W 1.4非線性擬合方程統計分析,導入原始數據計算出抑制中劑量(ED50)值[10]。根據每個野燕麥種群的ED50值,計算不同野燕麥種群的相對抗性倍數[11]。ED50值的計算公式:

(1)

式中:x表示鮮重抑制率;e表示ED50值;c和d分別代表置信區間的下限和上限;b代表e附近的相關斜率。

相對抗性倍數(RI)=抗性種群的ED50值/敏感種群ED50值。

(2)

參考 Beckie等的方法[12],將相對抗性倍數分為 4 個等級:RI<2 表示敏感或不抗種群(S),2≤RI<5 表示低水平抗性種群(L),5≤RI≤10 表示中水平抗性種群(M),RI>10表示高水平抗性種群(H)。

2 結果與分析

2.1 不同野燕麥種群對精唑禾草靈的敏感性

表2 不同野燕麥種群對精唑禾草靈的敏感性Table 2 Susceptibility of different populations of A. fatua to fenoxaprop-P-ethyl.

2.2 抗精唑禾草靈野燕麥種群ACCase基因序列分析

表3 不同野燕麥種群ACCase基因突變位點比對Table 3 Comparison of ACCase gene mutation sites in different populations of A. fatua

3 討論與結論

雜草對除草劑產生抗性已成為麥田作物草害治理的重大難題之一,為了有效控制雜草的危害、延緩抗藥性的發展,對野燕麥的防除采用綜合防治的策略,同時做到科學用藥,并選用不同作用機制的除草劑交替使用[29]。