大豆細胞色素P450 家族GmCYP78A71 固氮功能解析

楊占武 杜匯 邢馨竹 李文龍 孔佑賓 李喜煥 張彩英

摘要：大豆可與根瘤菌互作進行共生固氮，有效緩解其對土壤氮素的依賴。細胞色素P450（cytochromeP450，CYP450）是一種血紅素單加氧酶，參與植物信號分子、植物激素和黃酮類等多種次生代謝物的合成，為探究其在大豆結瘤固氮中的生物學功能，分析了該家族GmCYP78A71 基因的結構，并對其表達模式及生物學功能進行了深入解析。qRT-PCR和轉啟動子大豆毛根的根瘤GUS染色表明，GmCYP78A71 在根瘤中特異表達，且隨著根瘤的發育表達量逐漸增高，在成熟根瘤中達到峰值；與對照相比，超表達復合植株的根瘤個數、鮮重、固氮酶活性等顯著提高，而RNAi 毛狀根的根瘤個數、鮮重、固氮酶活性等顯著降低。上述結果表明GmCYP78A71 對根瘤的生長發育和固氮發揮重要作用。

關鍵詞：大豆；共生固氮；根瘤；細胞色素單加氧酶；優異種質doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0843

中圖分類號：Q78；S565.1 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2023）01005008

大豆（Glycine max）起源于我國，是人類最重要的食用油和植物蛋白來源，同時大豆在食品加工、飼料和燃料制造等領域也具有舉足輕重的作用[1]。大豆需氮較多，過量施用氮肥會導致土壤板結和水體富營養化等問題[2-5]。大豆與根瘤菌（rhizobial bacteria）互作形成根瘤，根瘤菌在根瘤中形成類菌體，在固氮酶作用下高效固定空氣中氮氣使其轉變為可被大豆吸收利用的氨。根瘤生物固氮可提供大豆生長發育所需氮素的50%～60%[6-10]，是實現農業綠色環保的有效途徑。

細胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）廣泛存在于自然界，是由超基因家族編碼的血紅素單加氧酶[11]，其分為包含CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746的單家族簇和由CYP71、CYP72、CYP85、CYP86 組成的多家族簇[12]。CYP450參與植物多種代謝途徑，所產生的次生代謝產物在植物體信號傳導以及應對生物和非生物脅迫中發揮著重要作用[1314]。CYP78A家族含有1個高度保守的單加氧酶結構域，是CYP71多家族簇的重要成員[14]。模式植物擬南芥的CYP78A家族包含6個成員（CYP78A5～CYP78A10），主要調控植物種子大小及油分含量[1516]；水稻的CYP78A家族不僅表現出對赤霉病的抗性還能調控籽粒大小和生長速度[17]；擬南芥中超表達CYP78A5可導致莖扭曲以及花器官發育缺陷[18]；CYP78A7調控擬南芥葉綠體和葉片大小，CYP78A6 和CYP78A9 在調控葉片衰老過程中發揮重要作用[19]；CYP78A家族成員在苔蘚中參與配子體形成[20]；大豆GmCYP78A70 和GmCYP78A57 表達量分別與葉片大小和百粒重呈正相關[21]；大豆CYP450家族成員共有332個，其中CYP78A 家族部分成員在根瘤中特異表達[22]，但其他基因對根瘤發育及固氮影響鮮有報道。

本課題組對大豆根瘤不同發育時期轉錄組數據分析發現，CYP78A家族成員GmCYP78A71 在大豆根瘤中特異表達，且表達量隨著根瘤的生長發育逐漸增高，28 d成熟根瘤中表達量達到峰值。為此，本研究克隆了GmCYP78A71 基因，并對其表達量和啟動子進行表達分析和功能驗證等，以明確GmCYP78A71 在大豆結瘤固氮中的生物學功能，為高固氮優異新種質創制及新品種培育提供基因資源并奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

大豆栽培品種Williams 82 和發根農桿菌K599均由河北農業大學大豆課題組提供，慢生型根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110 由中國科學院遺傳與發育生物學研究所饋贈。大腸桿菌感受態細胞TOP10購自北京博邁德生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒以及RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；2×SYBR qRT-PCR 定量染料、限制性內切酶、T4DNA 連接酶和cDNA反轉錄試劑盒均購自寶生物工程有限公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

YMB 培養基：K2HPO4·3H2O 0.66 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、NaCl2 0.1 g·L-1、Mannitol10 g·L-1、Yest extract 0.4 g·L-1。

無氮營養液：2.5 mmol·L-1 K2SO4、2 mmol·L-1MgSO4·7H2O、1 mmol·L-1 KH2PO4、0.15 mmol·L-1FeCl2、1.5 mmol·L-1 CaSO4·2H2O、4.6×10-2 mmol·L-1H3BO3、9.1×10-3 mmol·L-1 MnCl2·4H2O、7.5×10-4mmol·L-1 ZnSO4、5×10-4 mmol·L-1 CuSO4、1.1×10-4mmol·L-1 MoO3、9.4×10-5 mmol·L-1 CoCl2·6H2O。

1.2 試驗方法

1.2.1 根瘤菌液制備及接種 將-80 ℃保存的大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110接種到YMB液體培養基，28 ℃、180 r·min-1搖床震蕩培養5 d，用蒸餾水稀釋至OD600為0.08備用。

挑選飽滿均勻的大豆種子用氯氣（鹽酸∶次氯酸鈉=1∶24）消毒4 h，在裝滿蛭石的花盆中播種2粒。待大豆2片子葉完全展開時，每盆保留1株長勢較好的植株，并接種5 mL稀釋的根瘤菌液，定期澆灌無氮營養液。分別在接種根瘤菌10、17、21、28、35 d取大豆根瘤；接菌28 d取根、莖和葉，用液氮速凍-80 ℃保存。大豆培養在人工氣候室：16 h光照/8 h黑暗，光強6 000～6 500 lx，濕度50%～60%，晝溫28 ℃，夜溫23 ℃。

1.2.2 GmCYP78A71 生物信息學分析 在植物基因組網站Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）調取GmCYP78A71（Glyma.11G250200）基因信息，將氨基酸序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行Blast比對，明確基因分類及家族成員。根據Phytozome數據庫調取家族成員在大豆不同組織的表達量數據，利用HemI軟件作圖。

1.2.3 GmCYP78A71 克隆及qRT-PCR 提取28 dpi（days post infection，接菌后天數）成熟根瘤的總mRNA，反轉錄成cDNA，以cDNA 為模板利用GmCYP78A71 特異引物（表1）擴增目的基因全長ORF。PCR程序：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min，12 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，用T4 DNA連接酶將回收的目的片段與pMD19-T載體16 ℃連接過夜并轉化TOP10感受態細胞。在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上37 ℃過夜培養，挑取單克隆進行PCR檢測，將陽性單克隆送金唯智生物科技有限公司測序分析，測序無誤命名為T-GmCYP78A71。

利用RNA 提取試劑盒分別提取10、17、21、28、35 dpi 根瘤以及接菌28 dpi 的根、莖、葉的mRNA并反轉錄為cDNA，以反轉錄的cDNA為模版，利用GmCYP78A71 qRT-PCR特異引物和大豆內參引物（Actin11-F/R，表1）進行qRT-PCR。qRT-PCR 程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，30 個循環；12 ℃保存。采用2-ΔΔCT 方法[23]計算基因相對表達水平。

1.2.4 GmCYP78A71 啟動子克隆及表達模式分析 以大豆Williams 82基因組DNA為模板，利用GmCYP78A71 啟動子特異引物（Promoter-F/R，表1）擴增啟動子并進行瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段；利用限制性內切酶PstⅠ和BamHⅠ雙酶切（37 ℃、30 min）目的片段和PcamG載體，酶切產物利用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接并轉化TOP10感受態細胞，陽性克隆送金唯智生物科技有限公司進行測序分析，命名為pCYP78A71：：GUS。利用質粒小提試劑盒提取pCYP78A71：：GUS 質粒轉化發根農桿菌K599并侵染大豆下胚軸誘導轉基因毛根[24]，K599誘導的幼苗在蛭石培養12 d，根部只保留1條陽性毛狀根，同時每棵接種5 mL USDA110菌液，每盒15 棵陽性苗，每周定期澆灌4 L 無氮營養液。分別取10、17、21、28 dpi 根瘤進行GUS染色[19]，分析GUS著色部位。

1.2.5 GmCYP78A71 生物學功能解析 用XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切T-GmCYP78A71 質粒，回收目的片段與相同酶切處理的超表達載體pCAMBIA1304通過T4 DNA連接酶連接，構建GmCYP78A71 基因超表達載體；以T-GmCYP78A71 質粒為模板利用RNAi 特異引物（表1）擴增目的片段，分別用KpnⅠ、SpeⅠ和SacⅠ、BamHⅠ酶切目的片段和pTCK303載體，隨后用T4 DNA連接酶連接以構建RNAi載體（方法同1.2.4）。

GmCYP78A71 超表達和RNAi 載體分別轉化K599并侵染大豆誘導毛根，GUS染色，保留1條陽性根并接種根瘤菌USDA110，利用qRT-PCR檢測28 dpi轉基因根瘤中GmCYP78A71 表達量。采用乙炔還原法測定轉基因根瘤的固氮酶活性，將轉基因根瘤放入氣密性良好的10 mL采血管中，用注射器從采血管中抽出2 mL空氣，隨后向采血管中注入2 mL 乙炔氣體，將采血管于150 r·min-1、28 ℃搖床孵育3 h，抽取1 mL氣體進行氣相色譜檢測。色譜柱為安捷倫GS-ALUMINA 115-3532毛細管柱，載氣為N2，進樣量為1 uL，進樣口溫度120 ℃，柱溫60 ℃，檢測器溫度為200 ℃。統計每條轉基因毛狀根上根瘤的個數及鮮重，利用GraphPad Prism 7軟件進行數據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 GmCYP78A71 基因序列及家族分析

利用植物基因組數據庫在線網站Phytozome分析大豆GmCYP78A71（Glyma.11G250200）基因序列，結果顯示，該基因位于11號染色體且含有2個外顯子和1個內含子，其基因組序列全長為2 248 bp，其中CDS（Coding sequence）序列1 569 bp，5-UTR98 bp，3-UTR 245 bp，內含子336 bp（圖1A）。以大豆28 d根瘤cDNA為模板利用GmCYP78A71 基因CDS特異引物進行擴增，所得CDS測序結果與參考序列完全一致。GmCYP78A71 基因編碼522個氨基酸，含有1個CYP450家族保守結構域，屬于細胞色素P450單加氧酶CYP78A家族（圖1B）。在大豆中該家族有11個成員， GmCYP78A71 在根瘤中特異表達（圖1C），推斷GmCYP78A71 在大豆根瘤中發揮功能。

2.2 GmCYP78A71 表達模式分析

利用qRT-PCR 進一步驗證GmCYP78A71 在根、莖、葉及根瘤不同發育時期的表達模式，結果顯示，GmCYP78A71在大豆根瘤的表達量顯著高于其他器官且隨著大豆根瘤發育表達量逐漸增高，在28 dpi成熟的根瘤中表達量達到峰值（圖2）。上述結果表明GmCYP78A71 在根瘤中的高效表達與根瘤生長發育相關。

2.3 GmCYP78A71 啟動子表達模式分析

GmCYP78A71 啟動子融合GUS 載體通過K599 轉化大豆毛狀根，GUS 染色結果顯示，GmCYP78A71 啟動子在大豆根瘤中活性最高，且隨著根瘤發育著色逐漸加深直至根瘤成熟，這與qRT-PCR 結果一致（圖3），表明GmCYP78A71 基因在大豆根瘤生長發育和生物固氮中發揮重要功能。

2.4 GmCYP78A71 在大豆根瘤中的生物學功能解析

將超表達載體pCAMBIA1304-GmCYP78A71、RNAi載體pTCK303-GmCYP78A71分別轉化K599發根農桿菌并誘導大豆毛狀根，根據GUS染色結果篩選陽性毛狀根，測定28 dpi成熟瘤的生物學功能，結果顯示，超表達根瘤中GmCYP78A71 的表達量較對照提高2.94倍，固氮酶活性、根瘤個數、根瘤鮮重較對照分別增加28.5%、31.9%和39.6%；RNAi根瘤中GmCYP78A71的表達量較對照降低46.1%，固氮酶活性、根瘤個數、根瘤鮮重分別降低33.5%、16.3%和22.8%（圖4）。以上結果進一步表明，GmCYP78A71調控大豆根瘤生長發育和生物固氮。

3 討論

CYP450是植物基因組中較大的家族之一，該家族成員在植物根、莖、葉、花、果實、種子中均有分布，并參與萜類、脂肪酸、信號分子、植物激素和黃酮類等多種次生代謝物的合成與代謝，在植物生長發育過程中發揮著重要作用[2526]。CYP78A隸屬于CYP71多家族簇，是CYP450家族的重要組成部分，參與植物體的多種生物學功能。CYP78A成員在植物不同器官特異性表達并行使不同生物學功能，擬南芥的CYP78A5 在莢中特異表達調控種子生長發育 [1516]；甜櫻桃的PaCYP78A9 在花和果實中通過介導中果皮細胞擴張和增殖調控甜櫻桃果實大小[27]；Zhao 等[1] 研究發現，GmCYP78A72 在大豆莢中表達量最高，超表達GmCYP78A72 可顯著增加種子大小。

近年來，隨著植物全基因組測序和組學分析技術的不斷發展為全面解析CYP450功能奠定了基礎。Guttikonda等[22]通過對大豆全基因組分析發現，大豆基因組中有332個細胞色素P450家族成員，CYP78A亞家族共有11個成員，其中GmCYP78A71在大豆根瘤中高表達；Hayashi等[28]通過對大豆結瘤相關轉錄組分析發現CYP450受結瘤因子誘導表達；Appleby等[29]發現，CYP450可顯著影響大豆根瘤固氮酶活性；Jung等[30]發現，苯丙烷代謝途徑的關鍵酶CYP450參與黃酮類物質的形成，能夠調控大豆與根瘤菌的互作進程。盡管前人通過組學等手段初步判斷CYP450可能參與大豆結瘤固氮過程，然而并未進行深入研究和驗證。本研究進一步證實GmCYP78A71 在根瘤中優勢表達；同時發現GmCYP78A71 表達量隨著根瘤的發育逐漸升高，在根瘤成熟期達到峰值，表明GmCYP78A71在大豆根瘤生長發育中具有重要作用。

同時，本研究利用GmCYP78A71 轉基因復合植株進一步表明，超表達GmCYP78A71 可有效增加大豆根瘤個數及根瘤鮮重，RNAi 轉基因毛狀根的根瘤個數和根瘤鮮重則顯著降低，證明GmCYP78A71 表達量能夠調控根瘤個數和根瘤發育，進而影響植株固氮量和生長發育，Jung等[30]研究證實CYP450能夠調控大豆與根瘤菌的互作進程，與本研究結果相一致。固氮酶活性是衡量根瘤固氮效率最直接的生理指標，超表達GmCYP78A71的根瘤中固氮酶活性顯著高于空載體對照，而轉基因RNAi根瘤的固氮酶活性顯著低于空載體對照，由此說明GmCYP78A71 表達量可顯著影響根瘤固氮酶活性，與Appleby等[29]研究結果一致。綜合分析表明，GmCYP78A71 在調控大豆結瘤固氮過程中扮演著重要角色，該研究結果為轉基因育種創制高效固氮新種質提供了功能基因。

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（責任編輯：溫小杰）