轉基因作物培育中考點分析和應用

邵江樵

(浙江省寧波市效實中學)

自1996年首例轉基因農作物產業化應用以來,全球轉基因技術研究與產業應用快速發展。品種培育呈現代際特征,目前全球轉基因生物新品種已從抗蟲和抗除草劑等第一代產品,向改善營養品質和提高產量的第二代產品,以及工業、醫藥和生物反應器等第三代產品轉變。轉基因作物的種植不僅提高農作物產量,并且通過減少農藥、化肥的使用,在改善農業生態環境方面也顯示出巨大的優勢。

轉基因作物的培育需要經過目的基因載體的構建、載體的農桿菌轉化、農桿菌與植株共培養、轉化植株的篩選和鑒定四個環節(如圖1)。以轉基因作物培育為情景的試題已成為選拔性考試中的熱點。

圖1 轉基因植物的培育示意圖

考點1:Ti質粒的改造

Ti質粒是農桿菌介導基因轉化的重要部件,它是農桿菌擬核區外的遺傳物質,為雙鏈環狀DNA分子,包括T-DNA區、毒性區(vir區)、接合轉移區和復制起始區4部分(如圖2)。其中,T-DNA區和毒性區參與了外源基因的轉移整合。

圖2 Ti質粒

T-DNA區是根瘤農桿菌侵染植物細胞時,在相關蛋白的作用下被切割下來整合至植物基因組的一段DNA分子。該區段分布一些與激素合成相關的基因,其表達產物能引起植物細胞激素紊亂,進而導致在根莖交界處長出一團不規則的帽狀結構——冠癭瘤的形成,嚴重影響植物的生長。

毒性區(vir區)是位于T-DNA以外的一段DNA分子,其基因編碼的蛋白質(如限制性核酸內切酶等)在T-DNA轉移、整合中起輔助作用,其本身不會與植物基因組整合。

用于基因工程的載體分子量越大轉化率越低,Ti質粒長度約200 kb左右,片段過大,不易操作。所以野生型Ti質粒需去除T-DNA區中的致瘤基因才能應用于植物基因工程。實踐中常見的操作是雙元載體系統:

微型Ti質粒含T-DNA;缺失vir基因;含有復制起點、標記基因和多克隆位點,能整合外源基因輔助Ti質粒含一整套vir區基因;缺失T-DNA區

兩種質粒構建完成后,采用一定的方法將它們轉入同一株農桿菌中,構成雙元載體系統,就能使T-DNA整合至植物基因組中。

應用:植物被野生型農桿菌感染后會產生瘤狀結構,主要原因是農桿菌的Ti質粒中含有生長素合成基因(A)、細胞分裂素合成基因(B)(如圖3所示)。

圖3

為防止農桿菌侵染植物細胞后使植物產生瘤狀結構,必須把T-DNA片段上的基因________(用字母表示)敲除或替換掉。

【參考答案】A、B

考點2:雙酶切

酶切的目的是使目的基因和Ti質粒之間具有相同的黏性末端,便于在DNA連接酶的催化下形成重組的Ti質粒。雙酶切可以避免目的基因和Ti質粒的自身環化、避免反向連接,確保目的基因的順利表達。對兩種限制性核酸內切酶的選擇需要考慮限制酶的識別序列,黏性末端、目的基因的轉錄方向和標記基因等。

應用:目的基因和Ti質粒的限制性核酸內切酶的酶切位點如圖4所示,為了獲得重組Ti質粒,應當挑選的限制性核酸內切酶是________。

圖4

【參考答案】SalⅠ和KpnⅠ

【解析】為了使重組Ti質粒含有標記基因——青霉素抗性基因,不能選擇限制酶ScaⅠ;又要切割目的基因左端,則必選限制酶SalⅠ;為切割目的基因的右端,在限制酶EcoRⅠ和KpnⅠ之間,需考慮目的基因表達的方向圖示,只能選擇限制酶KpnⅠ。

考點3:影響重組DNA分子(重組Ti質粒)形成效率的因素

構建好的基因表達載體需要包括目的基因、標記基因、啟動子、終止子和復制原點等。標記基因用于檢測目的基因是否導入,啟動子和終止子調控目的基因的表達,其中啟動子的作用是與RNA聚合酶結合驅使目的基因轉錄出mRNA。重組DNA分子形成的效率受目的基因和載體的質量和濃度、是否有互補的黏性末端、DNA連接酶的活性和量、反應時間、反應溫度和pH等因素的影響。

應用:當載體和外源DNA用同樣的限制性內切酶,或是用能夠產生________的同裂酶等切割時,所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配,可以被DNA連接酶(T4連接酶)催化生成________,形成重組DNA分子。但是,當靶片段(外源DNA)的末端與載體不匹配時,必須轉換其中一個或兩個片段的末端,以便使之連接。

【參考答案】相同的黏性末端 磷酸二酯鍵

考點4:重組Ti質粒導入時對農桿菌的處理

細胞處于能吸收和容納外源DNA的狀態稱為感受態,經特定處理后處于感受態的細胞稱為感受態細胞。處理常用的是氯化鈣法:先將快速生長的農桿菌置于經低溫(0℃)預處理的低滲氯化鈣溶液中,會造成細胞膨脹,同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構(介于液態與晶態之間的結構,既有液體的流動性,又有類似晶體結構的有序性),促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區域,誘導細胞成為感受態細胞。

當加入外源DNA后,Ca2+與外源DNA結合形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復合物,并附著在細菌細胞膜的外表面上。再將該體系轉移到42℃下經短暫的熱脈沖處理(90 s),細胞膜的液晶結構會發生劇烈擾動,并隨機出現許多間隙(孔洞),致使細胞膜通透性增加,便于外源DNA分子進入感受態細胞。

由于細胞膜的流動性,這種短時熱沖擊所致的間隙(孔洞)又可以被細胞自身所修復。

細菌細胞壁的成分是肽聚糖,壁的多孔性允許水和一些化學物質通過,大分子的物質不能通過,而CaCl2溶液處理可以使細胞壁出現孔洞,從而提高細胞壁的通透性。

應用:(浙江省2018年4月選考生物卷,節選)取CaCl2處理過的農桿菌與重組質粒在離心管內進行混合等操作,使重組質粒進入農桿菌,完成________實驗。在離心管中加入液體培養基,置于搖床慢速培養一段時間,其目的是________。

【參考答案】轉化 使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態

考點5:影響重組Ti質粒導入農桿菌效率的因素

在轉化過程中,并不是全部受體細胞都會導入重組DNA分子,真正導入的只是少數細胞,影響重組Ti質粒導入農桿菌效率的因素有①重組DNA的質量和濃度;②農桿菌的生長狀態與密度;③適宜的培養時間和條件等。

實驗證明,大于30 kb的重組質粒將很難進行轉化。轉化率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入外源DNA的量過多或體積過大時,則會使轉化率下降。一般DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%,1 ng的cccDNA(共價閉環DNA)即可使50 ul的感受態細胞達到飽和。

最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液,不要用已經多次轉接,或貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳,密度過高或不足均會使轉化率下降。

整個操作過程均應在無菌條件下進行,注意防止被DNA酶或雜DNA所污染,否則會影響轉化效率或引起雜DNA的轉入。整個操作均需在冰上進行,不能離開冰浴,否則細胞轉化率將會降低。

應用:(浙江省2018年11月選考生物卷,節選)為提高將重組DNA分子導入受體細胞的效率,除考慮導入方法、篩選條件、防止污染外,還需考慮的主要因素有________________(答出2點即可)。

【參考答案】重組DNA的質量和濃度、受體細胞的生長狀態與密度

考點6:篩選導入重組DNA分子(重組Ti質粒)的農桿菌

常用的方法為利用標記基因(抗性基因)在添加相應抗生素的選擇培養基上培養篩選。

將目的基因導入植物細胞,采用最多的方法是農桿菌轉化法。含有目的基因的農桿菌可根據標記基因進行篩選。若農桿菌在含有氨芐青霉素和四環素的培養基上都可以生長繁殖,農桿菌中________(填“是”或“否”)含有目的基因。原因是________。

【參考答案】否 在構建重組質粒時,為防止目的基因和質粒自身環化、避免反向連接,可選用HindⅢ和SalⅠ兩種限制酶,這樣含有目的基因的質粒中抗四環素的基因被破壞

考點7:農桿菌侵染植物細胞的轉化過程

圖6 農桿菌侵染植物細胞的轉化原理的示意圖

轉化過程如下:

①當植物受到創傷后,會分泌酚類化合物,吸引農桿菌移向植物細胞,然后與植物細胞相關受體蛋白特異性結合。

②農桿菌細胞膜上的相關受體蛋白結合酚類化合物后,使Ti質粒上的毒性區(Vir區)上的系列基因激活并表達出多種蛋白,包括DNA聚合酶和限制性核酸內切酶等。限制性核酸內切酶作用于T-DNA的底鏈上,將其切割形成單鏈T-DNA分子,單鏈T-DNA分子與特定蛋白結合形成不成熟T鏈復合物;另一些蛋白結合在農桿菌與植物細胞之間形成具有轉運功能的通道,協助不成熟T鏈復合物和一些蛋白進入植物細胞中。在轉運途中,不成熟T鏈復合物和有關蛋白結合,構成成熟T鏈復合物。

措姆嗚嗚地哭著，米九不停地揉搓著雙手，措姆的聲音又帶著濃重的鼻音：我本來想生個孩子證明了自己，他會讓我回去的，可萬萬沒想到，他在我隆起大肚子時，娶了個更年輕，更漂亮的，讓我徹底沒了回家的路。米九低低地嘆氣：姆姆，人生還很漫長，說不定他老了就后悔了，他就會把你接回家。措姆幽幽地：他都娶第三個老婆了，我還有什么盼頭？米九還是努力著讓措姆開心：也說不準，他前些天還給我打探你的消息呢！措姆哀怨：你就騙我吧，每次你都這樣說，可他看到我時躲得遠遠的，根本都不想見我。

③成熟T鏈復合物和一些植物細胞蛋白進一步識別結合,在植物細胞蛋白的協助下,經核孔復合體到達細胞核,最終在一些特定植物蛋白的協助下,含有目的基因的T-DNA與植物細胞基因組完成整合。

整合具有隨機性:整合幾個目的基因,整合到哪一條染色體,整合到染色體上的位置都是隨機的。

應用1:(浙江省2018年11月選考生物卷,節選)農桿菌介導法是目前植物轉基因的常用方法,該方法的基本過程是農桿菌感染植物時,________,并將其插入到受體細胞的基因組中。

【參考答案】攜帶目的基因的T-DNA轉移到受體細胞

應用2:(浙江省2021年1月選考生物卷,節選)三葉青為蔓生的藤本植物,以根入藥。由于野生三葉青對生長環境要求非常苛刻,以及生態環境的破壞和過度的采挖,目前我國野生三葉青已十分珍稀。

依據基因工程原理,利用發根農桿菌侵染三葉青帶傷口的葉片,葉片產生酚類化合物,誘導發根農桿菌質粒上vir系列基因表達形成________和限制性核酸內切酶等,進而從質粒上復制并切割出一段可轉移的DNA片段(T-DNA)。T-DNA進入葉片細胞并整合到染色體上,T-DNA上rol系列基因表達,產生相應的植物激素,促使葉片細胞持續不斷地分裂形成________,再分化形成毛狀根。

【參考答案】DNA聚合酶 愈傷組織

考點8:影響植物細胞轉化效率的因素

從農桿菌介導法的轉化原理可知,農桿菌的生長狀態、農桿菌的菌液濃度、植物細胞對農桿菌的敏感性(來源、發育狀態和基因型等)、共同培養的時間和溫度、共同培養的pH、侵染方式、超聲波、表面活性劑等因素會影響植物細胞轉化效率。提高轉化率的措施:①添加表面活性劑增強農桿菌和植物細胞間的吸附能力;②人為提高酚類化合物的含量,更加高效地激活vir基因表達;③采用超聲波處理植物,使植物組織形成微傷口,增加農桿菌的感染概率;④添加抗氧化劑去除植物細胞由于農桿菌感染形成的過氧化物,減少植物組織培養中愈傷組織的褐化,提高轉化效率。

應用:在利用農桿菌轉化植物受體細胞的過程中,為了吸引農桿菌移向植物受體細胞,需添加________物質。

【參考答案】酚類

考點9:對宿主細胞的選用要求

宿主細胞應具備的特點:①具有優良性狀;②有較高的遺傳穩定性;③細胞全能性表達充分;④易被農桿菌侵染等。

應用1:(浙江省2020年7月選考生物卷,節選)為獲得轉基因植株,農桿菌侵染的宿主一般要選用具有優良性狀、較高的遺傳穩定性、________及易被農桿菌侵染等特點的植物材料。若植物材料對農桿菌不敏感,則可用________的轉基因方法。

【參考答案】細胞全能性表達充分 顯微注射

應用2:(浙江省2022年6月選考生物卷,節選)為提高培育轉基因植株的成功率,植物轉基因受體需具有較強的________能力和遺傳穩定性。對培養的受體細胞遺傳穩定性的早期檢測,可通過觀察細胞內________形態是否改變進行判斷,也可通過觀察分裂期染色體的________,分析染色體組型是否改變進行判斷。

植物轉基因受體全能性表達程度的高低主要與受體的基因型、培養環境、繼代次數和________長短等有關。同時也與受體的取材有關,其中受體為________時全能性表達能力最高。

【參考答案】再生 細胞核 形態特征和數量 培養時間 受精卵

考點10:侵染后處理

與農桿菌共培養后的外植體表面及淺層組織中常常共生大量農桿菌,使轉基因植物容易生冠癭瘤,對外植體的正常生長會產生不利影響,必須進行脫菌培養以殺死和抑制農桿菌的生長。

方法:把共培養后的外植體轉移到含抑菌劑——抗生素的培養基上繼續培養生長,實現脫菌(去除農桿菌)和防止雜菌污染的目的。

選用的抗生素主要有青霉素類(羧芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素g等)、頭孢霉素類(頭孢霉唑林鈉、頭孢霉哌酮鈉、頭孢拉定、頭孢霉西林鈉、頭孢霉曲松鈉等)和大環內脂類(紅霉素、白霉素等),目前使用最多的是500 mg/L的頭孢霉素。

原理:各種抑菌劑對細菌的作用機理不盡相同,青霉素類抗生素與蛋白質結合,抑制轉肽酶交聯反應,從而阻礙細胞壁粘肽的合成,使細菌的細胞壁缺損,菌體高滲膨脹裂解,進而誘導粘肽水解酶激活而溶菌;頭孢霉素類抗生素對細菌的作用機理與青霉素類相似;大環內脂類抗生素是通過阻礙細菌蛋白質合成來抑制細菌繁殖。

通常需5～6次繼代培養,直至培養基不產生農桿菌的菌落。

應用:(浙江省2021年1月選考生物卷,節選)依據基因工程原理,利用發根農桿菌侵染三葉青帶傷口的葉片,葉片產生酚類化合物,誘導發根農桿菌質粒上vir系列基因表達形成DNA聚合酶和限制性核酸內切酶等,進而從質粒上復制并切割出一段可轉移的DNA片段(T-DNA)。T-DNA進入葉片細胞并整合到染色體上,T-DNA上rol系列基因表達,產生相應的植物激素,促使葉片細胞持續不斷地分裂形成愈傷組織,再分化形成毛狀根。剪取毛狀根,轉入含頭孢類抗生素的固體培養基上進行多次________培養,培養基中添加抗生素的主要目的是________。

【參考答案】繼代 殺滅發根農桿菌

考點11:篩選轉化體

在目的基因導入受體細胞時,并不是每個細胞的染色體上都會整合含目的基因的T-DNA,可以利用抗生素作為選擇劑,用于篩選轉化體。氨基葡萄糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、潮霉素等)是常用的選擇劑。抗生素抗性基因是篩選轉基因植物常用而有效的標記基因,轉基因植物中所用的抗生素抗性基因包括nptⅡ(提供卡那霉素、新霉素抗性)、aph(4)-Ⅰ(提供潮霉素抗性)、bla(提供氨卞青霉素抗性)、aae(提供慶大霉素抗性)等。

選擇劑能夠對轉基因植物進行篩選實質上是抗生素抗性基因起作用。由于不同植物的不同外植體對抗生素的敏感性不一樣,在轉化之前應對選擇劑設置一系列的濃度梯度,找出既能有效抑制非轉化細胞生長,又對轉化細胞影響較小的篩選劑濃度。

應用:通過生物工程技術對油菜進行改造,以得到含有基因A的油菜,流程如圖7。

圖7 轉基因油菜的培育示意圖

圖7過程④中要防止雜菌污染的原因是________。可以通過在培養基中添加________作抑菌劑,理由是________。

【參考答案】雜菌會競爭培養基中的營養物質,還可能產生有毒有害物質 適宜濃度的潮霉素 重組質粒的T-DNA中含有潮霉素抗性基因,會與目的基因A一起插入油菜體細胞染色體的DNA上,它的成功表達使轉化細胞具有對潮霉素的抗性而成活,而雜菌與非轉化細胞由于潮霉素的作用死亡

考點12:目的基因在植物細胞中的檢測

分子水平:用同位素標記的目的基因作探針,使用核酸分子雜交技術檢測目的基因的轉錄;用抗原—抗體雜交技術檢測目的基因指導的蛋白質的合成。

個體水平:對個體進行抗性試驗。

應用1:(浙江省2019年4月選考生物卷,節選)將抗病基因通過轉基因的方法導入植物的分生組織可獲得抗病性強的植株。若在試管苗期間用分子水平方法判斷抗病基因是否表達,應檢測________(A.質粒載體 B.轉錄產物 C.抗性基因 D.病原微生物)

【參考答案】B

應用2:圖8表示“華恢l號”抗蟲水稻主要培育流程:

圖8

組建理想的載體需要對天然的質粒進行改造。圖9是天然土壤農桿菌Ti質粒結構示意圖(示部分基因及部分限制酶作用位點),據圖分析人工改造質粒時:

圖9

①用限制酶Ⅰ處理,其目的是:去除質粒上的________和________(填基因),保證T-DNA進入水稻細胞后不會促進細胞的分裂和生長;要使抗蟲基因能成功表達,還應插入________。

②若用限制酶Ⅱ分別切割經過①過程改造的理想質粒和帶有抗蟲基因的DNA分子,并構成重組Ti質粒。分別以含四環素和卡那霉素的培養基培養已成功導入抗蟲基因的水稻胚細胞,觀察到的細胞生長的情況是:在含四環素的培養基中________,含卡那霉素的培養基中________。