體外模擬消化篩選抗消化降糖肽及降糖活性研究

韓 迪，蘇 情，田曉閩，3，張學(xué)軍，張西平，孫琳琳，龔魁杰，郭玉秋，劉開(kāi)昌，陳利容

（1. 煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái) 264000；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，山東 濟(jì)南 250100；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266000；4. 山東天久生物技術(shù)有限公司，山東 菏澤 274108；5. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

高血糖是糖尿病的主要特征，長(zhǎng)期的高血糖癥狀會(huì)引發(fā)眼病、心血管病、腦血管病等各種慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重者危及生命[1]。目前，包括阿卡波糖、二甲雙胍在內(nèi)的治療T2DM 的6 類(lèi)長(zhǎng)效或短效藥物都有一定的副作用，會(huì)對(duì)患者的身體造成不同程度的損害，且合成藥物成本高、價(jià)格昂貴[2]。因此，具有良好降低血糖功效的天然產(chǎn)物受到了廣泛關(guān)注。

生物活性肽是一類(lèi)對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類(lèi)化合物，其中具有降血糖功能的肽類(lèi)多用于開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療糖尿病或肥胖癥的藥物[3]。降糖肽一般是由2～15 個(gè)氨基酸殘基組成的短肽，其降血糖能力也與降糖肽的含量及氨基酸組成有關(guān)[4]。降血糖原理主要分為2 種，一是驅(qū)動(dòng)胰島β 細(xì)胞分泌胰島素，增強(qiáng)胰島素敏感性；二是競(jìng)爭(zhēng)性抑制α - 葡萄糖苷酶活性，阻斷α-1,4 糖苷鍵水解，延緩淀粉在小腸分解為葡萄糖，抑制餐后血糖快速上升。

降糖肽通常通過(guò)口服的方式進(jìn)入人體，在胃和腸道中進(jìn)行消化吸收。有研究表明[5]，胃和腸道中的蛋白酶、pH 值等均會(huì)影響生物活性肽在人體胃腸道中的吸收與釋放。馮曉文等人[6]通過(guò)體外模擬消化試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，消化后的乳清肽ORAC 值明顯提高。王倩等人[7]則發(fā)現(xiàn)海地瓜多肽體外模擬消化后，降糖活性下降。目前，對(duì)模擬消化后降糖肽的生物活性研究，已經(jīng)成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)。因此，經(jīng)體外模擬消化方法，篩選獲得具有高活性的降糖肽，并開(kāi)展人體餐后血糖試驗(yàn)驗(yàn)證，為降糖肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海洋魚(yú)肽、螺旋藻肽、豌豆肽、牡蠣肽、大豆肽、小麥肽、乳清肽；胃蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司提供；胰酶、DPP-IV 酶，美國(guó)Sigma 公司提供；α - 葡萄糖苷酶，上海源葉生物科技有限公司提供；對(duì)硝基苯-α-D- 葡萄糖苷（99%），上海麥克林生化科技有限公司提供，其余試劑均為分析純。

SQP 型電子分析天平，上海賽多利斯產(chǎn)品；Sorvall ST 8R 型離心機(jī)，美國(guó)賽默飛產(chǎn)品；SHA-B型恒溫振蕩器，常州國(guó)華產(chǎn)品；DK-98-IIA 型電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特產(chǎn)品；FE28 型pH 計(jì)，瑞士梅特勒- 托利多產(chǎn)品；Varioskan LUX 型酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛產(chǎn)品；Onetouch 血糖儀，深圳強(qiáng)生產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 消化前后降糖肽α - 葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定

（1） 消化前降糖肽α - 葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定。將樣品用0.1 mol/L（pH 值6.8） 磷酸鉀緩沖液（PBS） 配置成4 mg/mL 的溶液，在96 孔酶標(biāo)板中加入樣品液40 μL，1 U/mL α- 葡萄糖苷酶溶液20 μL，于37 ℃下保溫10 min，再加入1×10-3mol/L 對(duì)硝基苯-α-D- 葡萄糖苷（PNPG） 溶液40 μL，于37 ℃下保溫10 min，最后加入1 mol/L Na2CO3溶液100 μL 終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)405 nm 處測(cè)定樣品組吸光度（A樣品），用PBS 代替PNPG 作為樣品背景組（A樣品背景），用PBS 代替樣品作為空白組（A空白），用PBS 代替樣品和PNPG 作為空白背景組（A空白背景） α - 葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

（2） 消化后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定。制備人工胃液：取240 mL HCl 溶液（pH 值2），胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g） 1.8 g，搖勻后，加水稀釋至300 mL，置于4 ℃冰箱備用。制備人工小腸液：取磷酸二氫鉀2 g，加水150 mL 使其溶解，用0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8，取胰酶3 g，加水適量使溶解，將以上配制的溶液混合后，加水稀釋至300 mL，置于4 ℃冰箱中備用。

以人工胃液和腸液為溶劑，添加樣品質(zhì)量濃度控制為4 mg/mL。取1 mg 樣品，加入20 mL 人工胃液，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min 震蕩2 h 后，pH 值調(diào)至6.8，移入20 mL 人工小腸液搖勻，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min 振蕩3 h，最后85 ℃滅酶10 min，降至室溫后進(jìn)行超濾離心處理，保留濾出液，根據(jù)1.2.1（1） 方法測(cè)定消化后降糖肽的α- 葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.2 降糖肽抗氧化活性的測(cè)定

（1） 降糖肽羥基自由基清除率測(cè)定。參考龐忠莉[8]的方法，將樣品配制成溶液，稀釋至0.2，1.0，5.0，10.0，20.0 mg/mL 的梯度溶液，向其中分別加入0.009 mol/L 的FeSO4溶液1 mL，0.009 mol/L 的水楊酸- 乙醇溶液（50%乙醇溶液） 1 mL，用漩渦振蕩器混合均勻，加入H2O2（0.03%） 溶液1 mL 啟動(dòng)反應(yīng)。將混合液置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，若有沉淀產(chǎn)生，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心5 min，上清液于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)得樣品吸光度（A1），用1 mL蒸餾水代替樣品，其他條件不變作為對(duì)照組（A2），用50%乙醇代替水楊酸- 乙醇溶液1 mL，其他條件不變作為空白組（A0），羥基自由基的清除率計(jì)算見(jiàn)公式（2）：

計(jì)算羥基自由基清除率半數(shù)抑制濃度IC50。

（2） 降糖肽DPPH 自由基清除率測(cè)定。參考馮曉文等人[6]的方法。將活性肽分別配置成1，2，5，10，20 mg/mL 的溶液，取0.2 mmol/L DPPH（95%乙醇溶解） 0.5 mL 與降糖肽溶液0.5 mL，混勻，避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定樣品吸光度（A樣品），同時(shí)以95 %乙醇加樣品作空白組（A空白），DPPH 溶液加上95%乙醇為對(duì)照組（A對(duì)照），DPPH自由基清除率計(jì)算見(jiàn)公式（3）：

計(jì)算DPPH 自由基清除率半數(shù)抑制濃度IC50。

（3） 降糖肽總還原能力測(cè)定。參考趙紅星[9]的方法，取1 mL 不同濃度的樣品溶液（1，2，5，10，20 mg/mL），與0.2 mol/L 磷酸鈉緩沖液2.5 mL（pH=6.6） 和1% （W/V） 鐵氰化鉀水溶液2.5 mL 混合，50 ℃保溫30 min，迅速冷卻，再加入10% （V/V）的三氯乙酸水溶液2.5 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10 min，取2.5 mL 上清液，加蒸餾水2.5 mL 和0.1%（W/V） 的氯化鐵水溶液0.5 mL，混合均勻。反應(yīng)10 min 后于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)吸光度，用吸光值大小代表總還原能力。

1.2.3 降糖肽對(duì)餐后血糖濃度的影響測(cè)定

選取男女各5 名空腹血糖和糖耐量正常，無(wú)代謝性疾病，消化系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及家族糖尿病史，身體健康，近期內(nèi)未服用可能影響糖代謝藥物的成年人，平均年齡在25.17±1.17 歲，所有研究對(duì)象年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），被試者在試驗(yàn)前均已簽署知情同意書(shū)。測(cè)定試驗(yàn)對(duì)象餐后240 min 內(nèi)血糖濃度變化。

GI 測(cè)定按照WS/T 652—2019《食物血糖生成指數(shù)測(cè)定方法》：Wolever 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化前后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率

消化前后降糖肽的α- 葡萄糖苷酶抑制率見(jiàn)圖1。

圖1 消化前后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率

由圖1 可知，未經(jīng)過(guò)體外模擬消化的蛋白短肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率差異不大，均在31.5%以下，但是經(jīng)體外模擬消化后的不同降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率均發(fā)生不同程度的變化，其中豌豆肽、小麥肽、大豆肽、牡蠣肽、乳清肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率較消化前高，且牡蠣肽和乳清肽的增加為原來(lái)的2.5 倍，分別為72.09%和69.91%。根據(jù)張廷新等人[10]的研究，降糖肽的生物活性主要取決于其含量和氨基酸序列組成，因此，降糖肽體外消化前后α - 葡萄糖苷酶抑制率變化有2 種原因：第1 種是由于體外消化酶對(duì)不同降糖肽的水解程度不同導(dǎo)致的，根據(jù)Yao R 等人[11]研究，生物活性肽對(duì)α -葡萄糖苷酶的抑制活性在一定范圍內(nèi)隨水解度增加而增加；第2 種是由于酶解后降糖短肽的氨基酸組成不同導(dǎo)致的，根據(jù)Hatanaka T 等人[12]的研究，通過(guò)切割不同部位的肽鍵，產(chǎn)生不同氨基酸組成的二肽基肽酶抑制肽，對(duì)二肽基肽酶抑制率的IC50值相差11 倍以上。結(jié)果表明，牡蠣肽和乳清肽最適合用作人體降糖肽。

2.2 降糖肽的抗氧化活性

降糖肽的抗氧化活性見(jiàn)圖2。

圖2 降糖肽的抗氧化活性

由圖2（a） 可知，乳清肽和牡蠣肽的羥基自由基清除率都隨樣品濃度增加而增強(qiáng)，乳清肽和牡蠣肽的羥基自由基清除率IC50值分別為5.40，7.32 mg/mL，與龐忠莉[8]的研究一致。因此，乳清肽和牡蠣肽對(duì)于羥自由基具有良好的清除效果。由圖2（b） 可知，乳清肽和牡蠣肽的DPPH 自由基清除率都隨樣品質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，乳清肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)和乳清肽質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時(shí)，DPPH 自由基清除率超過(guò)90%，IC50值分別為6.66，2.53 mg/mL，與馮曉文等人[6]的研究一致。因此，乳清肽和牡蠣肽對(duì)于DPPH 自由基具有良好的清除效果。由圖2（c）可知，乳清肽和牡蠣肽在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，A700顯示的吸光度與質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)性，即總還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而升高[9]，當(dāng)乳清肽和牡蠣肽質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL 時(shí)，A700值接近于0.4，均顯示出較高的還原能力。結(jié)果表明，乳清肽和牡蠣肽均具有良好的抗氧化性。

2.3 降糖肽對(duì)人體餐后血糖濃度的影響

降糖肽對(duì)人體餐后血糖濃度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 降糖肽對(duì)人體餐后血糖濃度的影響

由圖3 可知，人體餐后血糖濃度呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，進(jìn)食120 min 之后血糖濃度基本趨于穩(wěn)定，進(jìn)食饅頭后再服用乳清肽和牡蠣肽，血糖濃度增加速率變緩，另外，進(jìn)食饅頭血糖濃度峰值在進(jìn)食后30 min，為9.13±0.15 mmol/L，在服用乳清肽和牡蠣肽后，血糖濃度峰值延后，為進(jìn)食后45 min，分別為8.23±0.15 mmol/L 和8.63±0.15 mmol/L，且乳清肽組血糖濃度峰值低于牡蠣肽。根據(jù)2.1 結(jié)果，乳清肽和牡蠣肽被人體消化后，仍能夠有效抑制α -葡萄糖苷酶活性，抑制淀粉在小腸分解為葡萄糖，從而降低餐后血糖濃度升高速率。有研究表明，降低血糖濃度的另一個(gè)途徑是，通過(guò)刺激胰島素分泌來(lái)增加葡萄糖消化。因此，圖3 中服用乳清肽后血糖濃度峰值低于牡蠣肽，可能是乳清肽對(duì)胰島素產(chǎn)生的促進(jìn)作用高于牡蠣肽。

根據(jù)人體餐后血糖濃度變化結(jié)果，以葡萄糖GI值為參照，計(jì)算饅頭GI 值為79.09，食用饅頭后，再分別食用乳清肽或牡蠣肽，測(cè)得饅頭的GI 值分別為63.14 和67.44，分別降低為饅頭本身GI 值的79.83%和85.26%，降糖效果明顯。因此，乳清肽和牡蠣肽均能減少人體餐后血糖上升，適合用作人體降糖肽。

3 結(jié)論

對(duì)豌豆肽、螺旋藻肽、海洋魚(yú)肽、小麥肽、大豆肽、牡蠣肽和乳清肽7 種降糖肽進(jìn)行體外模擬消化篩選，α - 葡萄糖苷酶抑制率試驗(yàn)篩選出牡蠣肽和乳清肽是適合用作人體食用的降糖肽，羥基自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總還原能力結(jié)果得出乳清肽和牡蠣肽具有良好的抗氧化活性，人體餐后血糖濃度變化和GI 值結(jié)果得出，牡蠣肽和乳清肽均能夠明顯降低人體餐后血糖水平。