原花青素提取及分離純化方法的研究進展

張媛雯，趙琳，鄭天翔，陳語欣，譚偉

棗莊學院食品科學與制藥工程學院（棗莊 277160）

原花青素（procyanidine，PC）是一類在植物中廣泛存在的多酚化合物，是一種天然的抗氧化物。1961年首次從英國山楂新鮮果實中提取出該物質，至今已有40多年的歷史[1]。原花青素是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚化合物，也稱縮合單寧[2]，具有強有力的抗氧化、清除自由基能力，對人體微循環有特殊改善的雙重功效，以高效、低毒、高生物利用率而著稱[3]?？萍嫉倪M步與消費者對食品感官要求的不斷提高，推動了國內外研究者對原花青素分離、純化領域的研究。該文主要對原花青素的提取、分離、純化方法進行綜述，旨為原花青素的產業化應用提供理論基礎。

1 原花青素的提取方法

目前，國內外主要采用有機溶劑提取、超聲波輔助提取、超臨界CO2萃取、微波輔助提取及酶提取等方法提取原花青素。從操作難易程度、提取率、能源消耗、適用性等方面對5種方法進行對比，如表1所示。

1.1 有機溶劑提取法

有機溶劑提取法是依據不同成分在不同有機溶劑中溶解度不同的原理，將活性成分從原料中提取出來。因操作簡便、設備簡單等優點，有機溶劑提取法已實現工業化操作，但在提取過程中易造成熱不穩定成分的破壞，同時存在有機溶劑使用量大、提取物雜質含量較高、污染環境等缺點。不同的研究者所用有機溶劑種類不同，提取率也有所不同。安鳴等[4]以廢酒花為原料，分別用50%的乙醇與70%的丙酮提取原花青素，結果發現50%乙醇的提取量（45.36 mg/g）明顯大于70%丙酮的提取量（21.94 mg/g）。只德賢等[5]用65%乙醇提取白刺果原花青素，得率平均值為17.289±0.402 mg/g。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波能夠破碎植物細胞壁，便于溶劑進入細胞內，使植物中有效成分與溶劑結合，提高提取率[6]。該法具備高效、適用性廣、提取率高且提取藥液雜質少等優點，常與有機溶劑法共用。錢玉玲等[7]優化了蔓越莓原花青素的超聲波輔助提取條件，以50%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20（g/mL），70 ℃下提取40 min時，原花青素得率高達11.65%。譚永鵬等[8]以50%乙醇為提取劑提取黑枸杞中原花青素，當料液比1∶29（g/mL），220 W超聲26 min時，原花青素得率為6.10%。

1.3 微波輔助提取法

在微波環境中提取活性成分，使目的組分加速溶出的同時不會造成活性成分的結構破壞[9]。該法提取效率高、熱效率高，具有短時、節能、控制方便、對活性物質破壞小等[10-11]優點。張星和等[12]通過單因素試驗和正交試驗優化了火棘果原花青素提取工藝，采用85%乙醇，料液比1∶40（g/mL），560 W微波80 s，提取率最高為12.51 mg/g。Neto等[13]采用共晶溶劑（ESs）與微波輔助相結合的方式提取葡萄皮渣中的原花青素，不僅大大縮短提取時間，而且提高了提取得率和平均聚合度。李瑞麗等[14]以50%乙醇為提取劑，在料液比1∶6（g/mL），80 ℃微波處理20 min，葡萄籽原花青素的提取量為51.77 mg/g。在眾多試驗結果中，比較不同提取方法原花青素的提取率，微波輔助提取法所得原花青素提取率最高。

1.4 超臨界二氧化碳萃取法

超臨界二氧化碳萃取法通過控制溫度和壓力，改變超臨界二氧化碳的密度和溶解能力，使它與待分離物質接觸，有選擇地把極性不同、沸點不同和分子量不同的成分萃取出來，然后通過減壓升溫，使超臨界CO2變為氣體，被萃取物質析出，從而達到了分離純化的目的[15]。胡佳興等[16]以甲醇為夾帶劑從葡萄籽中萃取原花青素，在萃取壓力32 MPa，萃取溫度40 ℃，CO2流量為10 L/h的條件下萃取60 min，原花青素含量最高，為11.424 mg/g。顏雪琴等[17]以乙醇為夾帶劑萃取石榴皮中的原花青素，當采用65%的乙醇、料液比1∶1.3（g/mL）、CO2流速為5 L/h、35 MPa下提取58 min時提取率為3.40%。該法適合萃取固態物質，溶解速率高、無毒無污染，但設備要求高，投資大，難以推廣。

1.5 酶提取法

酶提取法主要是利用各種生物酶分解植物細胞壁，使細胞內活性物質擴散、溶解，可避免原花青素的活性遭到破壞。該法易于操作、條件溫和、綠色無污染，是一項前景廣闊的技術[18]。韓卓等[19]優化了紫薯原花青素的提取方法，在料液比1∶30（g/mL），pH為6.2，添加150 μg/mL纖維素酶，43 ℃下酶解65 min，原花青素提取率為5.039%。楊豆等[18]通過正交試驗優化了果膠酶和纖維素酶提取葡萄籽中原花青素的提取工藝，在料液比1∶21（g/mL）、pH 5，添加1.0%的復合酶、50 ℃酶解60 min的條件下，所得提取率為3.805%。

2 原花青素的純化分離方法

經提取后的原花青素仍含有多糖、黃酮類化合物、蛋白等雜質，需進一步分離純化后，才能進行結構分析、功能性研究或工業應用。通過對多項分離純化方法的應用與了解，總結了各類工藝的特點，見表2。

表2 分離純化工藝特點

2.1 大孔樹脂吸附法

大孔吸附樹脂因其價格低廉、操作簡便等特點，被廣泛應用于天然植物活性成分的分離、純化，在原花青素純化研究領域應用最多。大孔樹脂種類豐富，常用的有聚酰胺、ADS-17、AmberliteXAD-16、AB-8等。譚永鵬[20]用AB-8大孔樹脂純化黑枸杞原花青素，當上樣量5 BV，上樣流速2.0 mL/min，用50%乙醇洗脫，洗脫流速2.0 mL/min，洗脫量6 BV時，得到的原花青素純度為86.75%。Musdzalifah等[21]將紅高粱種子中的原花青素分別用大孔樹脂D101和AB-8進行吸附分離，結果表明后者對原花青素有更高的吸附能力，其吸附容量可達34.65 mg/g，回收率為79.64%。伍勇等[22]從巨峰葡萄籽中提取原花青素后，用HPD-400大孔樹脂純化粗提液，上樣流速為1.0 mL/min，用50%乙醇在pH 7.5的條件下洗脫，經純化后的原花青素純度可達94.17%。

經大孔樹脂初步純化后的原花青素仍含有較多雜質，純度較低，因此還需再次進行純化。紀秀鳳等[23]采用HPD100大孔樹脂對紅樹莓籽原花青素吸附后，分別用40%和60%的乙醇洗脫得到低聚原花青素、高聚原花青素，最后利用聚酰胺二次純化，在最佳工藝條件（上樣液體積100 mL，上樣液2 mg/mL，上樣流速1.5 mL/min，解吸流速1.5 mL/min，70%的乙醇作為解吸劑，解吸劑體積為150 mL）下，得到的低聚原花青素純度為71.09%，較初步純化純度提高了18.73%。王丹陽[24]先用AB-8型大孔吸附樹脂對葡萄籽原花青素進行初步純化，純度達77.34%，再利用Sephadex LH-20進一步純化，洗脫液濃縮后原花青素含量為90.52%。

2.2 膜分離過濾法

膜分離技術興起于20世紀初，于60年代發展為將物質分離提純的新興技術，是一種物理篩分技術。膜分離的種類有微濾（micro filtration，MF）、超濾（ultra filtration，UF）、納濾（nano filtration，NF）、電滲析（electrodialysis，ED）、反滲透（reverse osmosis，RO）[25]。該技術綠色、高效、易操作，在水相溶劑中亦可使用，并不會發生相變。

陳文良等[26]采用微濾、超濾的膜分離技術分離純化葡萄籽低聚原花青素，在1.0 MPa的操作壓力下，選擇10萬道爾分子量規格的膜，制得產品的截留率最低，且低聚原花青素的含量較高。張娣等[27]用膜分離和樹脂吸附相結合的方法純化蓮房原花青素，在最適宜工藝條件下超濾獲得透過液，再用HZ-806樹脂純化，得到的原花青素純度在81%以上，高于直接進行膜分離的原花青素純度。Bazinet等[28]采用電滲析和超濾膜結合技術純化濃縮紅莓汁中的原花青素和花青素，兩者總濃度分別提高了34.8%和52.9%。

膜分離技術在常溫下進行，不會破壞物質結構，熱敏性物質也可采用該技術。但其過濾設備價格高昂，生產成本高，難以工業推廣。

2.3 凝膠色譜法

凝膠色譜法可用于原花青素提取液經初次純化后進行進一步的分離純化，提高純度，與高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）聯用，可進行結構鑒定。Tovopearl-HW-40、Sephadex LH-20和Sepherdex 75HR是常用的凝膠色譜填料。

Ling等[29]利用Me2CO/H2O萃取蓮子房原花青素，Sephadex LH-20色譜柱進行純化，得到純度大于98%的產物。Kawahara等[30]使用Amberlite XAD-1180N、Toyopearl HW40F和Sepacore C-18反相閃蒸柱層析法，把紅小豆的原花青素濃縮成5個餾分。Pedan等[31]通過Sephadex LH-20凝膠色譜柱，將原花青素B2和C1二聚體和三聚體成功分離。張馳等[32]用大孔樹脂層析法分離純化沙棘果中的原花青素時含量高達71.9%，該粗品經SephadexLH-20柱分離，50%乙醇作為流動相，可純化至95%以上。楊雪娜[33]用Sephadex LH-20凝膠柱純化從龍眼、冷撒果果皮中的原花青素，得到了高純度的原花青素。

凝膠色譜法可以分離不同類型的原花青素，分離純化效果最好，節省時間，提高效率，但其設備昂貴，維護成本高，投資大，不易推廣。

2.4 高速逆流色譜法

高速逆流色譜技術（HSCCC）是依據化合物在不相溶兩相間的分配能力不同，對植物中天然活性物質進行分離的液液分配色譜技術[34]。

Luo等[35]采用高速逆流色譜法對白葡萄皮中原花青素不同組分進行純化，在3 mL/min流速、兩相系統為己烷-乙酸乙酯-水、950 r/min轉速的情況下，純化后組分純度可達90%以上。左春穎等[36]采用高速逆流色譜法將葡萄籽原花青素分離為6個組分，所得原花青素以高聚體為主要存在形式，低聚體占比少，總產率達85.1%。

高速逆流色譜技術是一種新興的分離提純技術，其避免了載體對提取物的污染和吸附，溶劑使用量少，同時具有高效、簡便等優點，但設備成本高，不宜推廣。

3 結語

原花青素具有廣泛的生物活性，從天然植物中提取分離純化原花青素，綠色、無公害，可用于藥品、食品和化妝品等領域。與國外的研究相比，國內關于原花青素提取分離純化的研究內容多樣性、提取技術的先進性等方面仍稍有欠缺，因此，國內的原花青素仍有較高的研究價值。