LncRNA XIST靶向miR-543對膠質瘤細胞增殖凋亡的作用機制研究

蘭偉途 王萬宏 武峰 蘭文達 何建昌

【摘要】 目的 探討長鏈非編碼RNA（LncRNA）XIST通過miR-543對膠質瘤細胞增殖凋亡的作用及機制。方法 RT-PCR檢測膠質瘤細胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783中XIST表達水平及si-XIST轉染U251細胞后XIST與miR-543表達；在膠質瘤細胞U251中敲低XIST后，MTT法、流式細胞術檢測膠質瘤細胞的增殖和凋亡情況；用雙熒光素酶報告基因驗證LncRNA XIST與miR-543的靶向關系。結果 XIST在U251細胞中表達水平（0.79±0.08）最高，故以U251細胞進行后續實驗；與XIST組［（2.35±0.17）、（0.37±0.05）］相比，si-XIST組U251細胞XIST表達水平（0.25±0.19）較低，miR-543表達水平（3.15±0.36）較高（P＜0.05）；與XIST組［（0.57±0.09）、（0.81±0.01）、（1.15±0.04）］相比，si-XIST組膠質瘤U251細胞A570在24、48、72 h［（0.22±0.02）、（0.31±0.03）、（0.55±0.04）］明顯降低（P＜0.05）。與XIST組（1.12±0.56）%相比，si-XIST組細胞凋亡率（35.64±4.31）%較高（P＜0.05）。共轉染XIST-wt和miR-543處理組中相對熒光素酶活性顯著下降［（1.15±0.22）vs（0.22±0.03）］（P＜0.05）。結論 干擾LncRNA XIST可通過靶向負調控miR-543表達，抑制膠質瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡。

【關鍵詞】 LncRNA XIST；miR-543；膠質瘤細胞；增殖；凋亡

【中圖分類號】 R734.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0158-05

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of long non coding RNA（LncRNA） XIST on proliferation and apoptosis of glioma cells through miR-543. Methods RT-PCR was used to detect the expression of XIST in U251， T98G， U87-MG， A172 and SW1783 glioma cell lines and the expression of XIST and miR-543 in U251 cells transfected with si-XIST. After knocking down XIST in U251 glioma cells， MTT assay and flow cytometry were used to detect the effects on proliferation and apoptosis of glioma cells. Double luciferase reporter gene was used to verify the targeting relationship between LncRNA XIST and miR-543. Results The expression level of XIST in U251 cells was（0.79±0.08）， so U251 cells were used for follow-up experiments. Compared with XIST group［（2.35±0.17），（0.37±0.05）］， the expression level of XIST in U251 cells in si-XIST group（0.25±0.19） was lower， miR-543（3.15±0.36） is highly expressed（P＜0.05）. Compared with XIST group［（0.57±0.09）， （0.81±0.01）， （1.15±0.04）］， A570 of glioma U251 cells in si-XIST group decreased significantly at 24， 48 and 72 h［（0.22±0.02）， （0.31±0.03）， （0.55±0.04）］（P＜0.05）. Compared with XIST group（1.12±0.56）%， the apoptosis rate of si-XIST group was（35.64±4.31）% （P＜0.05）. The relative luciferase activity was significantly decreased in the co-transfected XIST-wt and mir-543 groups［（1.15±0.22）vs（0.22±0.03）］（P＜0.05）， these results suggested that there was a targeted relationship between XIST and miR-543 and XIST negatively regulates the expression of miR-543. Conclusion Silencing LncRNA XIST can negatively regulate the expression of miR-543 inhibit the proliferation and induce apoptosis of glioma cells， which may be a molecular target of glioma.

Key words： LncRNA XIST; miR-543; glioma cell; proliferation; apoptosis

基金項目：河北省2020年度醫學科學研究課題計劃（20200172）

作者單位：061000 滄州，河北省滄州市人民醫院醫專院區神經外科（蘭偉途，武峰，蘭文達，何建昌）；唐山市豐南區醫院神經外科（王萬宏）

膠質瘤為中樞系統最常見惡性腫瘤，因其浸潤性生長方式造成致殘率、死亡率較高，患者經常規治療后中位生存時間僅15個月［1］。故研究抑制膠質瘤的分子機制，探索潛在的精準治療靶點已成為相關領域研究熱點。研究發現長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）可能與microRNA（miRNA）互相作用，影響膠質瘤進展［2］。LncRNA XIST為染色體失活特異轉錄物（X-inactivation-specific transcript X，XIST）基因產物，被證實是有生物學功能的LncRNA［3］。研究表明，LncRNA XIST在膠質瘤細胞中呈高表達，可促進膠質瘤細胞生長、侵襲，且與患者生存時間及預后相關，可作為膠質瘤生物標記物［4］。miRNA與腫瘤之間的關系已成為腫瘤學研究熱點之一，miR-543是一種促癌基因，Zhang等［5］報道，miR-543在膠質瘤發展中發揮關鍵作用。然而，關于LncRNA XIST、miR-543在膠質瘤中的相互作用機制尚不清楚。本研究通過敲低XIST表達，探討XIST對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 人膠質瘤細胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783購自美國典型培養物保藏中心。XIST干擾劑（si-XIST）及其陰性對照（si-XIST-NC）、miR-543模擬物及其陰性對照（miR-543-NC）（海吉瑪制藥技術有限公司），實時定量PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒、Lipofectamine 2 000轉染試劑盒、熒光素酶報告檢測試劑盒（美國ThermoFisher公司），實驗所用引物由上海科華生物工程股份有限公司合成。

1.2 細胞培養 用含有10%胎牛血清和0.1%的青霉素和鏈霉素的DMEM培養基培養U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783，培養環境為5% CO2、37 ℃，隔天換液1次，細胞融合率達到85%以上時傳代，傳代濃度1×104個/mL。

1.3 RT-PCR檢測不同膠質瘤細胞株中XIST表達水平 用Trizol試劑提取膠質瘤細胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783及用si-XIST轉染后的U251細胞總RNA，定量分析后，每組取等量RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀擴增，用實時定量PCR試劑盒進行定量分析。反應程序：95 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s，循環40次。用2-△△Ct法定量分析各細胞系中XIST相對表達量。

1.4 細胞分組與轉染 將細胞分組為對照組、XIST組、XIST-NC組、si-XIST組、si-XIST-NC組，接種于6孔板，培養24 h后，參考轉染試劑盒說明書用XIST、XIST-NC、si-XIST、si-XIST-NC分別轉染XIST組、XIST-NC組、si-XIST組、si-XIST-NC組細胞，對照組加入等量載體處理。轉染6 h后更換為正常細胞培養液培養，待后續檢測使用。

1.5 MTT法檢測膠質瘤細胞增殖活性 取si-XIST轉染U251細胞48 h后的對數生長期細胞制成單細胞懸液，2×103/孔接種于96孔板，每組設置8個平行孔。轉染培養后24、48、72 h取出培養板，加入20 μL MTT液培養4 h，吸出上清液加入150 μL二甲基亞砜振蕩溶解，酶聯免疫檢測儀在570 nm波長檢測各細胞的吸光度值。

1.6 流式細胞術檢測膠質瘤細胞凋亡率 取各組轉染后對數生長期的U251細胞接種于6孔板內，繼續培養48 h，收集細胞洗滌2次，根據凋亡試劑盒說明書操作，用400 μL標記緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），用流式細胞儀檢驗細胞凋亡率。

1.7 RT-PCR檢測XIST與miR-543表達水平 收集轉染后U251細胞，提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行Real-time PCR反應合成XIST與miR-543，XIST以GAPDH為內參，miR-543以U6為內參。反應程序：95 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、59 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，35個循環。引物見表1。用2-△△Ct法定量分析U251細胞中XIST、miR-543相對表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因驗證XIST與miR-543靶向關系 經生物信息預測XIST與miR-543的結合片段，用PCR擴增，插入熒光素酶報告酶載體，構建XIST野生型（wild type，wt）質粒。用基因突變技術對XIST序列上與miR-543結合位點上個別核苷酸進行突變，構建XIST突變型（mutant type，mut）質粒。用miR-543模擬物及陰性對照與XIST-wt或XIST-mut共同轉染U251細胞，24 h后檢驗熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內參，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0統計軟件分析本次實驗數據，XIST、miR-543相對表達量等計量資料以均數±標準差（x-±s）表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較進行LSD-t分析。以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各膠質瘤細胞株中XIST表達水平 如圖1所示，XIST在多種膠質瘤細胞株中表達水平以U251細胞最高，故選擇U251細胞進行后續實驗。

2.2 U251細胞XIST與miR-543表達情況 與對照組及各自NC組相比，XIST組U251細胞XIST表達水平較高，miR-543表達水平較低，si-XIST組U251細胞XIST表達水平較低，miR-543表達水平較高（P＜0.05）；與XIST組相比，si-XIST組U251細胞XIST表達水平較低，miR-543表達水平較高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 敲低XIST抑制膠質瘤細胞增殖活性 敲低XIST表達后，各組膠質瘤U251細胞A570隨時間延長而升高。與對照組及各自NC組相比，XIST組膠質瘤U251細胞A570在24、48、72 h較高（P＜0.05），si-XIST組膠質瘤U251細胞A570在24、48、72 h較低（P＜0.05）；與XIST組相比，si-XIST組膠質瘤U251細胞A570在24、48、72 h明顯降低（P＜0.05），表明敲低XIST可抑制膠質瘤U251細胞增殖。見圖3。

2.4 敲低XIST促進膠質瘤細胞凋亡 敲低XIST表達后，與對照組及各自NC組相比，XIST組細胞凋亡率較低（P＜0.05），si-XIST組細胞凋亡率較高（P＜0.05），與XIST組相比，si-XIST組細胞凋亡率較高（P＜0.05），表明敲低XIST可誘導U251細胞凋亡。見表2、圖4。

2.5 XIST與miR-543的靶向關系 生物信息預測結果顯示，XIST序列中含有與miR-543互補的序列（圖3A所示）。雙熒光素酶報告實驗顯示（圖3B所示），共轉染XIST-wt和miR-543處理組中相對熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），表明XIST與miR-543有結合關系；轉染XIST-MUT和miR-543的處理組中相對熒光素酶活性未受影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

3 討 論

腫瘤發生發展是多通路活化或抑制、多因子參與、多步驟的生物學過程，基因異常表達與失調在腫瘤微環境創建及其發生發展中占據重要地位。據了解，人類基因組基本上都可轉錄LncRNA，與編碼基因相比，LncRNA的轉錄方式不同［6］。據報道，LncRNA有干擾轉錄、誘導染色體重塑、改變細胞結構等功能，可通過與miRNA、蛋白質分子或其組合相互作用，發揮著抑癌或促癌作用［7］。最近，LncRNAs和miRNAs之間的相互作用引起了很多關注。多項研究報道，LncRNA異常表達不但會影響真核細胞基因表達，還可通過調控細胞增殖使其獲得無限增殖能力，提升癌癥發生率，并誘導癌癥轉移與惡化［8-9］。Luo等［10］發現LncRNA CASC11可通過miRNA-150促進膀胱癌細胞的增殖。Liu等［2］報道，LncRNA參與了膠質瘤血管生成過程。因此研究LncRNA在膠質瘤中分子作用機制十分必要，可為膠質瘤臨床治療提供新思路。

XIST最早在1991年被發現，后續研究表明其在多種癌癥病理進程中呈異常表達。Salama等［11］報道，XIST在乳腺癌中表達明顯上調。Liu等［12］發現，XIST下調可抑制非小細胞肺癌發展。XIST參與了X染色體滅活啟動階段，同時參與了細胞全部過程，影響癌癥增殖與凋亡［13］；可見，XIST在膠質瘤中也發揮了相同作用。為此，本研究首先檢驗了XIST在幾種膠質瘤細胞株中的表達水平，結果發現U251細胞中XIST表達水平最高，故選擇U251細胞行后續實驗。細胞無限增殖為癌癥基本特征之一，抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡是臨床治療癌癥的主要途徑。經MTT與流式細胞術檢驗發現，敲低XIST表達后，膠質瘤U251細胞A570在24、48、72 h均明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，提示敲低XIST可抑制膠質瘤U251細胞增殖活性，并誘導其凋亡。Luo等［14］發現XIST在膠質瘤中也發揮癌基因功能，對膠質瘤增殖、遷移等生物學行為均有影響，本研究與其結果存在一致性。這些結果證明了XIST在膠質瘤中所扮演的癌基因角色以及對膠質瘤生物學行為的影響情況，而這一項研究結果為加深本研究對XIST在膠質瘤細胞生物學行為中潛在機制的理解提供了新的思路。

miR-543在人類14號染色體DLK1-DIO3區域，含有較大的非編碼RNA群，可通過調控各種靶基因影響癌癥的發生與轉移。Fan等［15］發現，miR-543可通過靶向KRAS、MTA1和HMGA2抑制結直腸癌的生長和轉移，因此認為miR-543是一種候選腫瘤抑制分子。但近幾年報道發現，miR-543也可發揮促癌基因的作用；Chen等［16］報道miR-543對腎細胞癌的增殖與轉移有促進作用；Wang等［17］表明miR-543可在口腔鱗狀細胞癌中充當新型致癌基因。由此可知，miR-543在不同腫瘤類型中發揮的作用不同，在膠質瘤細胞中發揮何種作用尚不明確。本研究通過RT-PCR檢測發現，敲低XIST后，U251細胞中XIST表達下調、miR-543表達上調，結合敲低XIST對U251細胞增殖、凋亡的影響研究結果可知，miR-543在膠質瘤中扮演促癌基因的角色。由此可見，miR-543表達上調對膠質瘤發生發展有促進作用，應高度重視膠質瘤診斷中miR-543的檢測，且在膠質瘤治療期間可通過干擾miR-543表達從而達到治療目的，但上述想法在臨床上是否可行，有待進一步研究證明。根據XIST與miR-543可能存在的結合位點構建包含miR-543在內的XIST-wt、XIST-mut基因報告載體，經雙熒光素酶報告基因實驗發現，XIST與miR-543存在靶向關系，由此可見，XIST可能是膠質瘤的分子靶點。

綜上所述，XIST在膠質瘤發展中發揮了致癌作用，敲低膠質瘤細胞U251細胞株中XIST表達，可抑制膠質瘤細胞增殖，并誘導其凋亡，XIST可通過靶向負調控miR-543影響膠質瘤細胞的生物學行為，可能是膠質瘤分子靶點，靶向XIST/miR-543可能是治療膠質瘤的新興方法，這對臨床治療膠質瘤而言是有意義的發現。但本研究亦存在一些缺陷，比如僅從敲低XIST了解其對膠質瘤細胞生物學行為的影響，未能從過表達XIST方面驗證本研究的結論，且單純觀察了膠質瘤細胞增殖活性、凋亡率，未能觀察敲低XIST對膠質瘤細胞侵襲、遷移等生物學行為的影響，這些未來會進一步完善。

［參 考 文 獻］

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（收稿2021-12-28 修回2022-04-14）