敏咳方對咳嗽變異性哮喘豚鼠炎性介質的影響

王琳 張曉文 羅世杰

摘 要：觀察敏咳方對咳嗽變異性哮喘豚鼠血清中炎性介質含量的影響，探討敏咳方治療咳嗽變異性哮喘的部分機制。將豚鼠隨機分為空白組、孟魯司特鈉組、敏咳方常量組、敏咳方高劑量組和模型組，采用復制咳嗽變異性哮喘豚鼠模型造模，分別給予藥物治療2周（除空白組），觀察各組豚鼠咳嗽次數和血清標本中IFN-γ、IL-4和CCL11的含量。結果表明，與模型組比較，經藥物干預的3組豚鼠咳嗽次數明顯減少（P＜0.05），與孟魯司特鈉組比較，敏咳方高劑量組豚鼠咳嗽次數明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，經藥物干預的3組豚鼠血清IL-4和CCL11的含量下降，IFN-γ含量升高（P＜0.05）；與孟魯司特鈉組比較，敏咳方高劑量組IL-4和CCL11的含量下降，IFN-γ含量升高（P＜0.05）。敏咳方可降低咳嗽變異性哮喘豚鼠血清IL-4和CCL11的含量，升高IFN-γ含量。敏咳方通過減少炎癥介質產生，抑制氣道炎癥，增強人體免疫力能達到治療咳嗽變異性哮喘的效果，且高劑量敏咳方對咳嗽變異性哮喘豚鼠療效最為顯著。

關鍵詞：咳嗽變異哮喘；敏咳方；IFN-γ；IL-4；CCL11

中圖分類號：R-332文獻標識碼：Ａ文章編號：1674-0033（2023）02-0091-06

引用格式：王琳，張曉文，羅世杰.敏咳方對咳嗽變異性哮喘豚鼠炎性介質的影響[J].商洛學院學報，2023，37（2）：91-96.

Abstract： To observe the effect of minke Prescription on Inflammatory Mediators in Guinea Pig Cough Variant Asthma. To explore some of the mechanisms of the treatment of cough-variant asthma. Divided into 5 groups， including the control group， montelukast sodium group， the conventional dose group of MinkePrescription， the high dose group of Minke Prescription， and the model group，replicating cough variant asthma guinea pig model modeling， Guinea pig drugs were given for 2 weeks （except the control group）. The number of coughs in guinea pigs and the contents of IFN-γ， IL-4 and CCL11 in serum samples were observed. The results show that： Compared with the model group， the number of coughs of guinea pigs in the three groups treated with drug intervention was significantly reduced （P<0.05）， and compared with the montelukast sodium group， the number of coughs in the high-dose group of the sensitive cough formula was significantly reduced （P<0.05）， and compared with the model group， the serum IL-4 and CCL11 contents of the three groups of guinea pigs treated with drug intervention decreased and the content of IFN-γ increased （P<0.05）. Compared with the montelukast sodium group， the content of IL-4 and CCL11 decreased in the high-dose group of Minmu formula， and the content of IFN-γ increased （P<0.05）. Minke Prescription can reduce the serum IL-4 and CCL11 levels and increase IFN-γ content in cough-variant asthma guinea pigs. By reducing the production of inflammatory mediators， inhibiting airway inflammation， and enhancing human immunity， the effect of treating cough-variant asthma is achieved， and high-dose minke Prescription? has the most significant effect on cough-variant asthma guinea pigs.

Key words： cough variant asthma; Minke Prescription; IFN-γ; IL- 4; CCL11

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）以慢性、刺激性咳嗽為主要癥狀，不伴有喘息等癥狀或體征，是一種特殊類型的哮喘，又稱為咳嗽型哮喘[1]，是兒科常見病和多發病。因其發病機制與病理變化與哮喘相似，又被稱為“隱匿性哮喘”。隨著工業化快速發展，大氣污染日益加劇，CVA發病率呈逐年上升趨勢[2]。研究調查顯示，中國兒童慢性咳嗽患病率為1.60%～26.42%，其中CVA占比約達41.95%[3]。CVA常在春秋季節轉換時發病較多，若不及時積極治療，則易轉變為典型哮喘，病程長且易反復發作，嚴重影響患兒的生活質量，甚至影響患兒的性格、情緒等[4]。然而，現代醫學關于CVA的發病機制仍在不斷探索當中，目前研究顯示，CVA 病理改變表現為多種細胞及炎性因子參與的氣道炎癥及氣道高反應[5]，諸多炎性介質參與導致氣道炎癥是CVA發生的本質特征。魏環[6]指出IL-4和IFN-γ與CVA氣道的慢性炎癥及氣道高反應性有著密切的聯系。柳萍飛[7]研究發現，健康兒童血清IL-4含量低于CVA患兒，IFN-γ含量高于CVA患兒。馬風桐[8]研究發現，CVA與Th1/Th2平衡失調也密切相關，Th1/Th2失調也可導致CVA發病。IFN-γ和IL-4不僅與氣道炎癥有關，而且作為維持Th1、Th2細胞的重要細胞因子，其含量變化在CVA病情變化中發揮著重要作用。CCL11是一類調節白細胞運輸的可溶性蛋白介質，在炎癥部位驅動白細胞聚集，若CCL11在局部增多，則會發生慢性炎癥與病理組織損傷，同時在咳嗽變異性哮喘病理機制中發揮高度趨化作用[9]，所以本研究選擇IFN-γ、IL-4和CCL11作為檢測指標。

中醫注重整體觀念和辨證論治，且中藥具有副作用小、多向靶點、價格低廉等優點，在治療CVA中日益受到重視。中醫將CVA歸屬于“咳嗽” “風咳” “哮咳”等范疇。羅世杰認為CVA主要病機為病久傷陰，發作時為外風引動伏痰，肺失宣降，肺氣上逆為主，治療應以“祛風宣肺，化痰滋陰止咳”為主，方選敏咳方[10]。本文圍繞敏咳方對CVA治療效果進行研究，同時，通過對IFN-γ、IL-4和CCL11的含量測定，探討敏咳方治療CVA的機制，以期為臨床用敏咳方治療CVA提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1 材料

在西咸新區灃東新城實驗動物養殖場（動物許可證：SCXK（陜）2017-002）購入2周齡（約（180±20）g）雄性豚鼠50只。適應性喂養3 d后，將購回的豚鼠隨機分為5組，放入不銹鋼鼠籠，飼養于本校醫學科研實驗中心動物房。室內溫度控制在20～26 ℃，濕度控制在40％～70％，室內光照周期采用12 h/12 h晝夜間斷照明。動物飼料喂養。

1.2 藥物

卵清蛋白凍干粉1 g（上海麥克林生化科技有限公司）、孟魯司特納咀嚼片（杭州默沙東制藥有限公司）、辣椒素50 mg（上海皓元生物醫藥科技有限公司）、水合氯醛250 g（上海標模科技有限公司）、吐溫-80（北京索萊寶科技有限公司）、豚鼠IL-4試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）、豚鼠IFN-γ試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）、豚鼠CCL11試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）、敏咳方免煎顆粒（四川新綠色藥業科技發展有限公司，陜西中醫藥大學附屬醫院免煎顆粒藥房提供）。

1.3 方法

1.3.1藥物的制備

4％卵蛋白溶液（OVA）：在25 mL的生理鹽水中放入1 g卵蛋白干粉配制成4％ OVA。

辣椒素溶液：將稱取的30.5 mg辣椒素加入1 mL吐溫-80溶液中，再加入1 mL無水乙醇溶液中溶解，最后加入生理鹽水8 mL，配成10-2 mol/L辣椒素原液。

敏咳方劑量：藥物濃度根據動物和人藥物用量換算公式[10]。動物體表面積計算法Meeh-Rubner氏公式計算為：

A（體表面積，以m2計算）＝K×W2/3/1000（1）

式（1）中，W為體重（g）；K為常用系數。

動物種類不同體表面積也不同，豚鼠的K為9.8，人的K為10.6。首先計算8歲兒童的體表面積（體重按8歲兒童標準體重24 000 g）A為0.88 m2。敏咳方的兒童臨床常用劑量為8 g/（kg·d）=218.18 m2/d。而豚鼠的體表面積（2周齡體重按200 g）A為0.034 m2，故等效劑量為37.09 g/（kg·d）（相當于8歲兒童臨床等效劑量），高劑量為74.18 g/（kg·d）（相當于8歲兒童臨床等效劑量2倍）。孟魯司特鈉給藥劑量為0.1 mg/（100 g·d）（相當于8歲兒童臨床等效劑量）。

1.3.２試驗動物分組

將50只豚鼠適應性喂養3 d后，按隨機原則和方法分為5組，每組10只，A組設為空白組、B組為孟魯司特鈉組、C組為敏咳方常量組、D組為敏咳方高劑量組、E組為模型組，見表1。

1.3.３造模方法

本次造模依據蔡黎等[10]在《山西醫科大學學報》發表的改進后的CVA豚鼠模型構建方法建立：利用 OVA 和氫氧化鋁致敏并用 OVA 激發的方法復制 CVA 模型豚鼠。在試驗開始第 1 天，B、C、D、E 組每只豚鼠均肌肉注射 4％ OVA 溶液 0.5 mL，并同時腹腔注射 2％氫氧化鋁 0.2 mL 第一次致敏；A 組以相同劑量的0.9%生理鹽水代替 OVA溶液及氫氧化鋁注射。試驗第7天，重復上述給藥過程進行第二次致敏，意在加強致敏，以防有部分豚鼠在第一次致敏后出現脫敏。試驗第14天，將 B、C、D、E組的每只豚鼠均放在密閉玻璃箱內，然后打開霧化器，用1％ OVA 溶液霧化攻擊，進行致敏后的激發（霧化率：0.5 mL/min），持續時間3 min，隔日1次，共7次（14 d），A組則以0.9%生理鹽水代替 1% OVA 溶液，保證每次各組的激發時間及劑量一致。

模型評估：攻擊激發咳嗽時觀察各組豚鼠反應情況，若有咳嗽、豎毛、口鼻分泌物增多、煩躁、頻繁抓臉、呼吸急促、噴嚏中兩種或兩種以上者，或出現腹肌收縮、抽搐等現象之一者，判定模型成功。

1.3.４標本采集與檢測方法

各組豚鼠在末次喂養后禁食12 h，稱量各組豚鼠體重并記錄后，給予豚鼠腹腔注射10％水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，然后將麻醉過的豚鼠固定在準備好的豚鼠固定板上，取仰臥位，心前區剪毛備皮，并用碘伏消毒皮膚，用注射器針頭垂直刺入心跳搏動最強處，為避免溶血，快速吸出血液樣本3 mL，轉移至離心管中，做好標記，在室溫下靜置30 min待自然凝固，然后放入4 ℃低溫高速離心機中以3 500 r/min，離心15 min，用清潔的微量移液器取上清液分裝于 EP 管中，做好標記，置于-80℃冰箱中待測，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組豚鼠IL-4、IFN-γ、CCL11的含量。首先用純化的豚鼠IL-4、IFN-γ、CCL11包被微孔板，然后給微孔中依次加入標本、標準品HRP標記的檢測抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，再經過溫育并徹底洗滌；加底物TMB 顯色；用酶標儀在450 nm波長下測定OD值，并通過標準曲線，計算樣品中豚鼠IL-4、IFN-γ、CCL11 的含量。

1.4 統計學方法

所有數據均采用SPSS22.0進行分析，統計方法為單因素方差分析和LSD檢驗法，均數±標準差為計量方法，檢測結果P<0.05 ，表示差異有統計學意義，反之，則表示差異無統計學意義。

2? 結果與分析

2.1 一般情況的觀察

A組豚鼠的習性正常，眼睛明亮有神，對捕捉反應能力好，對光照、聲響等外界環境變化十分敏感，奔跑迅速，被毛濃密且光亮，清潔貼身，食欲旺盛，有相當的飲食、水量，尿糞未見異常。

E組在以OVA霧化攻擊前一般情況和A組基本相同，在OVA攻擊的過程中，各豚鼠均表現出呼吸增快，出現抓耳撓鼻的洗臉樣動作，對捕捉的反應能力下降，獨隅一角。隨著霧化激發次數的增加，各豚鼠甚至出現對捕捉不反抗，扎堆嗜睡，眼半閉，被毛粗亂，無光澤，沾染糞便，食欲明顯減退，對飼料無反應，出現連聲咳嗽，體重增長下降，甚至出現體重不增長，在試驗結束時，有2只豚鼠死亡。

B、C、D組在OVA霧化攻擊前一般情況基本同A組，在OVA霧化激發初期，出現呼吸頻率加快、洗臉樣動作、打噴嚏等，和E組的癥狀類似，給藥物干預的過程中，上述癥狀有不同程度減輕，整體反應性明顯改善，對捕捉反應靈敏，被毛由粗亂恢復貼身光亮，洗臉樣動作明顯減少，飲食水量恢復，體重增加，D組的一般情況改善明顯好于其他藥物干預組。試驗結束時，E組有1只豚鼠死亡。

2.2 咳嗽次數測定

通過觀察八通道研究型高速記錄系統儀顯示的張力變化波狀圖和人工計數咳嗽次數相結合，準確的測定豚鼠2 min內咳嗽次數。將各組豚鼠膈肌處和上腹部纏上帶有掛繩的自粘彈性腹帶，并用固定器控制豚鼠，然后放其在玻璃缸內，啟動霧化器，霧化吸入10-4 mol/L辣椒素溶液60 s，關掉霧化機，讓豚鼠在玻璃缸內停留1 min后打開玻璃蓋，接通八通道研究型高速記錄系統儀，觀察揭蓋后2 min內八通道研究型高速記錄系統儀圖形的波動次數，并通過讀波動圖，數出每只豚鼠的咳嗽次數（如圖1），同時一人進行人工計數豚鼠此時間范圍內的咳嗽次數，并做記錄，準確的測定豚鼠2 min內咳嗽次數。結果見表2。

由圖1所示，當豚鼠咳嗽時會出現腹部抽動，腹肌壓力增大，刺激八通道研究型高速記錄系統儀顯示波動的圖像從而記錄當時的張力，通過觀察波形圖確定豚鼠的咳嗽次數。

如表2所示，E組豚鼠咳嗽次數明顯高于A組（P＜0.05），差異有統計學意義，說明采用改進后的CVA豚鼠模型構建方法造模成功；B、C、D組咳嗽次數較E組明顯減少（P＜0.05），說明孟魯司特鈉和敏咳方對CVA的治療有效；B組和C組咳嗽次數無明顯差別（P＞0.05），無統計學差異，說明孟魯司特納與敏咳方常劑量對CVA治療效果相同；D組咳嗽次數較C組明顯減少（P＜0.05），說明不同劑量敏咳方對咳嗽變異性哮喘療效不同，敏咳方高劑量對咳嗽變異性哮喘止咳效果最顯著。

2.3 豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、CCL11的含量的檢測

采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組豚鼠的IL-4、IFN-γ、CCL11的含量，檢測結果見表3。

如表3所示，E組豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量明顯高于A組，IFN-γ含量明顯低于A組（P＜0.05），有統計學差異，說明CVA復制模型成功。B、C、D組IL-4和CCL11的含量低于E組，IFN-γ含量高于E組（P＜0.05），說明孟魯司特鈉和敏咳方可以降低CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量，升高IFN-γ含量，減少炎癥因子的產生，降低氣道高反應，提高人體免疫力，從而達到治療CVA的效果。B組和C組的IL-4、CCL11和IFN-γ的含量無明顯差異（P＞0.05），說明孟魯司特納對降低CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量、升高IFN-γ含量和敏咳方常劑量相同，在治療CVA時，敏咳方常劑量和孟魯司特納對CVA患者療效相同。C組的IL-4和CCL11的含量高于D組，IFN-γ含量低于D組（P＜0.05），說明敏咳方高劑量對CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11降低和IFN-γ升高較敏咳方常量顯著，敏咳方高劑量對CVA患者療效優于敏咳方常劑量。

3? 討論與結論

CVA是兒童臨床常見病和多發病，西醫對其病因和發病機制仍在不斷探索中，治療上并無特效藥物可以根治此病，對CVA的治療主要參考哮喘治療方案，常選用β受體激動劑、糖皮質激素、白三烯受體拮抗劑、抗膽堿能藥物為主，雖能緩解臨床癥狀，但長期服用副作用大，且停藥后復發率高[11]。中醫注重整體觀念和辨證論治，且中藥具有副作用小、多向靶點、價格低廉等優點，在治療CVA中日益受到重視。陜西省名中醫羅世杰教授具有多年的臨床經驗，對兒童CVA病因病機有獨特的認識[12]，在CVA治療上頗有經驗。羅教授課題組成員運用敏咳方治療CVA，認為CVA的病因與風邪、伏痰密切相關。感受風邪是引起CVA的外在因素，伏痰是引起CVA的重要內在因素。CVA主要病機為病久傷陰，發作時為外風引動伏痰，肺失宣降，肺氣上逆為主。肺為華蓋，風邪入侵，首當犯肺。小兒肺臟嬌嫩，易受外邪侵襲，使肺主宣發肅降功能失調，肺氣上逆，引發咳嗽。小兒脾常不足，脾虛運化水谷精微失司，水谷精微聚集成痰，上犯入肺，外邪引動，則發為咳嗽。脾為肺之母，后天之本，脾虛肺失濡養，亦影響肺宣降之功能，引發咳嗽。正如徐春甫所言“痰氣互結、氣道受阻，肺氣逆而作咳”[13]。咳嗽時日過長，則邪氣郁久化熱，熱盛耗氣傷陰，而成陰虛咳嗽。故認為CVA的主要病機為病久傷陰，發作時為外風引動伏痰，肺失宣降，肺氣上逆。治療應以“祛風宣肺，化痰滋陰止咳”為主，自擬敏咳方。

敏咳方是由過敏煎和止嗽散加減而成，具體方藥為桔梗5 g、前胡8 g、杏仁8 g、炙百部9 g、五味子6 g、銀柴胡8 g、紫菀6 g、款冬花6 g、桃仁8 g、葶藶子10 g、連翹10 g、烏梅12 g、防風8 g、甘草6 g。方中紫菀、百部長于止咳化痰，對新久咳嗽皆有效。桔梗善開宣肺氣，前胡善降氣化痰，兩者配伍，一宣一降，恢復肺之宣降。杏仁、桃仁兩藥可潤腸通便，平喘止咳，通過泄濁氣達到宣肺氣，并且桃仁具有活血之功，還體現出治風先治血，血行風自滅之用藥特點。葶藶子、款冬花降氣化痰平喘，諸藥合用，增強止咳之效，同時還具有化痰平喘之功。防風辛溫發散，可祛除一切風邪，烏梅酸澀收斂，一收一散，使散不傷正，收不留邪；連翹、銀柴胡清宣肺熱，二藥合用不僅可祛除邪氣，還可以滋陰斂肺，防止病情發展。甘草調和諸藥。諸藥相配，有收有散，升降并舉，使祛邪不傷陰，滋陰不留寇，從而達到祛風宣肺，化痰滋陰止咳之效。現代藥理學研究顯示，敏咳方中防風能阻斷炎癥介質的傳遞途徑，降低血清中炎性因子產生[14]；烏梅可能是通過阻斷PI3K/Akt和MAPK細胞信號傳導通路，抑制肥大細胞脫顆粒，防風-烏梅藥對可抑制氣管平滑肌細胞（ASMCs）由收縮型向合成型的轉化，減輕支氣管平滑肌肥厚，減少一些炎癥介質釋放，降低氣道炎癥，改善CVA小鼠氣道重塑[15]；五味子能減少過敏皮膚組織的組膠、IgE受體基因表達，抑制肥大細胞釋放炎癥因子，具有抗炎作用[16]。銀柴胡可以抑制炎癥細胞產生釋放炎癥因子IL-4[17]。本研究顯示，敏咳方可降低CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量，升高IFN-γ含量，調節CVA模型豚鼠的免疫失衡狀態，干預TH1/TH2平衡，抑制氣道炎癥，降低氣道高反應，明顯改善CVA豚鼠的一般情況，減少CVA豚鼠的咳嗽次數，從而達到治療CVA的效果。

目前關于中藥治療兒童 CVA 的實驗室藥理機制研究仍較其他疾病少，今后應通過更多新的研究方法對中醫效驗方進行現代藥理藥效學研究，為中醫辨治兒童 CVA 提供更多實驗室證據。關于敏咳方治療CVA的作用機制，可從分子表達和信號通路方面深入研究；關于 CVA 的預防和長期管理，除臨床醫生應幫助 CVA 患兒早期識別和避免轉變為CA的危險因素外，或可基于“互聯網+”兒童醫療健康服務系統探索個性化、動態、全程的線上線下相結合的健康管理模式。

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