miR-429對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響及其機制

牛婷婷　吳琍　侯琳　仇碧茹　趙曉暉　李金洋

［摘要］ 目的 探討miR-429對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響及其機制。方法 采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法和免疫印跡法，分別檢測乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549細胞及正常乳腺上皮細胞MCF-10A的eIF4E mRNA和蛋白相對表達量。在MCF-7細胞中轉染miR-429 mimics（A組）、mimics NC（B組）、miR-429 inhibitors（C組）及inhibitors NC（D組），采用RT-qPCR法、CCK8法、細胞劃痕實驗和免疫印跡法檢測A～D組細胞miR-429表達情況、細胞增殖和遷移情況、eIF4E mRNA和蛋白相對表達量。在293T細胞中轉染eIF4E-3′UTR-Wt+miR-429 mimics（E組）、eIF4E-3′UTR-Wt+mimics NC（F組）、eIF4E-3′UTR-Mut+miR-429 mimics（G組）、eIF4E-3′UTR-Mut+mimics NC（H組），檢測E～H組細胞相對熒光素酶活性，分析miR-429對eIF4E的靶向調控作用。結果 RT-qPCR與免疫印跡檢測結果顯示，MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549細胞中的eIF4E mRNA以及蛋白的相對表達量均明顯高于正常乳腺上皮細胞MCF-10A（F=74.414、1 981.243，P<0.01）。RT-qPCR法檢測結果顯示，A組細胞的miR-429相對表達量明顯高于B組（t=25.390，P<0.01），而eIF4E mRNA相對表達量明顯低于B組（t=－6.363，P<0.05），C組細胞miR-429相對表達量明顯低于D組（t=－4.652，P<0.05），而eIF4E mRNA相對表達量明顯高于B組（t=－2.928，P<0.05）。CCK8實驗檢測結果顯示，與B組細胞相比，A組細胞第24、48、72小時時的增殖活力明顯降低（F=26.148～40.997，P<0.01）；與D組細胞相比，C組細胞第24、48、72小時增殖活力明顯增高（F=6.410～82.593，P<0.05）。細胞劃痕實驗顯示，A組細胞愈合率明顯低于B組（t=－22.584，P<0.01），C組細胞愈合率明顯高于D組（t=11.464，P<0.01）。免疫印跡法檢測結果顯示，A組細胞中eIF4E蛋白相對表達量明顯低于B組（t=－20.355，P<0.01），C組細胞eIF4E蛋白相對表達量明顯高于D組（t=3.622，P<0.01）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，各組細胞相對熒光素酶活性比較差異具有顯著性（F=366.823，P<0.05），而且E組細胞相對熒光素酶活性顯著低于F組（t=－42.961，P<0.01）。結論 miR-429或通過靶向調控eIF4E基因進而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。

［關鍵詞］ 乳腺腫瘤；微RNAs；真核細胞起始因子4E；細胞增殖；細胞運動

［中圖分類號］ R737.9

［文獻標志碼］ A

EFFECT OF miR-429 ON THE PROLIFERATION AND MIGRATION OF BREAST CANCER CELLS AND ITS MECHANISM＼ NIU Tingting， WU Li， HOU Lin， QIU Biru， ZHAO Xiaohui， LI Jinyang （Department of Breast Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of miR-429 on the proliferation and migration of breast cancer cells and its mechanism. Methods RT-qPCR and Western blotting were used to measure the relative mRNA and protein expression levels of eIF4E in breast cancer MCF-7， MDA-MB-231， MDA-MB-468， and BT-549 cells and normal breast epithelial MCF-10A cells. MCF-7 cells were transfected with miR-429 mimics （group A）， mimics NC （group B）， miR-429 inhibitors （group C）， and inhibitors NC （group D）， and RT-qPCR， CCK-8 assay， wound healing assay， and Western blotting were used to measure the expression of miR-429， cell proliferation and migration， and the relative mRNA and protein expression levels of eIF4E in groups A-D. The 293T cells were transfected with eIF4E-3′UTR-Wt+miR-429 mimics （group E）， eIF4E-3′UTR-Wt+mimics NC （group F）， eIF4E-3′UTR-Mut+miR-429 mimics （group G）， and eIF4E-3′UTR-Mut+mimics NC （group H）， and relative luciferase activity was measured for groups E-H. The targeted regulatory effect of miR-429 on eIF4E was analyzed. Results RT-qPCR and Western blotting showed that the relative mRNA and protein expression levels of eIF4E in MCF-7， MDA-MB-231， MDA-MB-468， and BT-549 cells were significantly higher than those in normal breast epithelial MCF-10A cells （F=74.414，1 981.243，P<0.01）. RT-qPCR showed that compared with group B， group A had a significantly higher relative expression level of miR-429 （t=25.390，P<0.01） and a significantly lower relative mRNA expression level of eIF4E （t=-6.363，P<0.05）; group C had a signi-ficantly lower relative expression level of miR-429 than group D （t=-4.652，P<0.05） and a significantly higher relative mRNA expression level of eIF4E than group B （t=-2.928，P<0.05）. CCK8 assay showed that compared with group B， group A had a significant reduction in proliferation activity at 24， 48， and 72 hours （F=26.148-40.997，P<0.01）， and compared with group D， group C had a significant increase in proliferation activity at 24， 48， and 72 hours （F=6.410-82.593，P<0.05）. Wound healing assay showed that group A had a significantly lower healing rate than group B （t=-22.584，P<0.01）， and group C had a significantly higher healing rate than group D （t=11.464，P<0.01）. Western blotting showed that group A had a significantly lower relative protein expression level of eIF4E than group B （t=-20.355，P<0.01）， and group C had a significantly higher relative protein expression level of eIF4E than group D （t=3.622，P<0.01）. Dual-luciferase reporter assay showed that there was a significant difference in relative luciferase activity between groups （F=366.823，P<0.05）， and group E had a significantly lower relative luciferase activity than group F （t=-42.961，P<0.01）. ConclusionThis study shows that miR-429 may inhibit the proliferation and migration of breast cancer cells through targeted regulation of the eIF4E gene.

［KEY WORDS］ Breast neoplasms; MicroRNAs; Eukaryotic initiation factor-4E; Cell proliferation; Cell movement

乳腺癌的發病率遠高于其他女性腫瘤，嚴重威脅著女性生命健康，已成為全球第一大常見腫瘤^[1]。微小RNA（miRNA）是在真核生物中內源性的具有調控功能的一類小分子非編碼RNA，其作用機制為通過與目的基因mRNA的3′非翻譯區（UTR）堿基互補配對結合，以轉錄后調節的方式調控靶基因的表達水平，影響細胞增殖、遷移等的生物學行為^[2]。miR-429屬于miRNA-200家族，作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發生發展中發揮著重要的調控作用^[3-4]。相關研究表明miR-429在乳腺癌中呈低表達，扮演抑癌基因的角色^[5]。真核細胞翻譯起始因子4E（eIF4E）可在翻譯起始時特異性識別結合真核mRNA的5′端帽子結構^[6]，通過使5′UTR解旋影響mRNAs的代謝、加工、運輸、翻譯等，在帽依賴的翻譯起始階段發揮限制調控作用，調控蛋白質合成^[7-9]。近年研究發現，eIF4E在乳腺癌組織中可能呈高表達，且其表達水平與乳腺癌的發生、浸潤和轉移密切相關^[10]。目前關于miR-429在乳腺癌發生進展中的調控機制尚不明確。本研究主要驗證和探討miR-429與eIF4E在乳腺癌中的靶向關系及其在乳腺癌細胞增殖、遷移中的作用，以求為乳腺癌的早期診斷、治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人正常乳腺上皮細胞MCF-10A、人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT-549以及293T細胞獲自青島大學醫學部分子生物學與生物化學實驗室。DMEM培養基購于武漢普諾賽生命科技有限公司，胰蛋白酶消化液、青/鏈霉素混合液、CCK-8試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購于自北京索萊寶生物科技有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購買于北京全式金生物；轉染試劑RNAi購于上海漢恒生物科技有限公司，Trizol Reagent購于美國Invitrogen公司，eIF4E抗體購于英國Abcam公司，GAPDH單克隆抗體購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 細胞培養及分組

將MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、MCF-10A、293T細胞置于含體積分數0.10胎牛血清和青/鏈霉素溶液的DMEM培養基中（其中青霉素濃度為1 000 U/L，鏈霉素濃度為1 mg/L），于37 ℃、含體積分數0.05 CO₂的細胞培養箱中常規培養，傳1～2代且待細胞融合度達到80%～90%時備用。在6孔板中培養MCF-7細胞，當其融合度達到60%～70%時，細胞分別轉染miR-429 mimics（A組）、mimics NC（B組）、inhibitors（C組）以及inhibitors NC（D組）。構建eIF4E-野生型（Wt）和eIF4E-突變型（Mut）重組質粒，接種239T細胞于6孔板中，37 ℃下培養，待其融合度約達40%時，分別轉染eIF4E-3′UTR-Wt+miR-429 mimics（E組）、eIF4E-3′UTR-Wt+mimics NC（F組）、eIF4E-3′UTR-Mut+miR-429 mimics（G組）以及eIF4E-3′UTR-Mut+mimics NC（H組）。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法和免疫印跡法檢測乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549以及正常乳腺上皮細胞MCF-10A中eIF4E mRNA、蛋白相對表達量

使用Trizol試劑提取MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、MCF-10A細胞RNA，逆轉錄構建cDNA，eIF4E mRNA以GAPDH為內參照，采用RT-qPCR法檢測各細胞系eIF4E mRNA的表達。上機反應條件為：95 ℃預變性5 min；然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共循環40次。各樣本重復檢測3次，以2^－△△CT方法計算eIF4E mRNA相對表達量。各引物序列見表1。

以RIPA裂解液裂解提取上述細胞中的蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，然后在SDS-PAGE上80 V電泳30 min，轉膜，室溫下以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入內參GAPDH一抗（1∶1 000）、目的基因eIF4E一抗（1∶2 000），4 ℃下過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h，用1×TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發光液1∶1加到PVDF膜上，室溫放置1 min，采用成像系統顯影、拍照并測量灰度值，以計算eIF4E蛋白的相對表達量。eIF4E蛋白相對表達量=eIF4E蛋白條帶灰度值/內參GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.4 CCK-8法檢測A～D組細胞增殖活力

收集轉染后各組MCF-7細胞以2 000個/孔接種至96孔板，37 ℃常規培養，每組設置5個復孔，待細胞貼壁后轉染，第0、24、48、72小時時分別向各孔細胞中加入10 μL CCK8檢測試劑，細胞培養箱內孵育2 h，酶標儀測定波長450 nm處各孔吸光（A）值，以吸光度值反映細胞的增殖活力。

1.5 細胞劃痕實驗檢測A～D組細胞遷移能力

準備6孔板，用馬克筆在6孔板背后畫橫線，橫線相隔1 cm。將A～D組細胞接種于6孔板內，待細胞生長至鋪滿整孔時，用200 μL槍頭垂直于6孔板背后橫線劃痕，此時可出現一條無細胞區域，用無血清培養基沖洗除去所有被刮下的細胞及碎片，在6孔板中每孔加入2 mL無血清培養基，拍照顯微鏡在第0、24小時時拍攝劃痕愈合的情況，并計算愈合率。愈合率=（24 h痕跡面積－0 h痕跡面積）/0 h痕跡面積×100%。

1.6 E～H組細胞雙熒光素酶報告基因活性檢測

在37 ℃下培養E～H組細胞48 h，收集各組細胞并接種于96孔板中。裂解細胞，離心取上清液備用，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒于多功能酶標儀中測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性值，并計算相對熒光素酶的活性值。相對熒光素酶的活性值=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.7 RT-qPCR法檢測A～D組細胞中miR-429、eIF4E mRNA相對表達量

使用Trizol試劑提取A～D組細胞總RNA，逆轉錄構建cDNA，miR-429以U6為內參照，eIF4E mRNA以GAPDH為內參照，采用RT-qPCR法檢測各組細胞miR-429及eIF4E mRNA的表達。上機反應條件同1.3。各引物序列見表1。

1.8 免疫印跡法測定A～D組MCF-7細胞eIF4E蛋白相對表達量

收集A～D組MCF-7細胞，RIPA裂解液裂解提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。采用免疫印跡法檢測各組細胞eIF4E蛋白的表達量。

1.9 統計學方法

使用SPSS 26.0軟件對實驗數據進行統計學分析，以Image J軟件處理圖像。所有實驗均獨立重復3次，結果取均值。各細胞系中eIF4E mRNA及蛋白均以MCF-10A作為對照，A、C組miR-429、eIF4E mRNA及蛋白以B、D組為對照，將數據進行歸一化處理。正態分布的計量資料以x?±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析，兩組不同時間比較采用重復測量設計方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各乳腺癌細胞系及正常乳腺上皮細胞eIF4E mRNA及蛋白表達情況

RT-qPCR法檢測結果顯示，乳腺癌MDA-MB-468、MCF-7、BT549、MDA-MB-231細胞以及正常乳腺上皮細胞MCF-10A的eIF4E mRNA相對表達量分別為2.077±0.119、1.443±0.055、1.175±0.064、1.113±0.041、1.000±0.057，各組比較差異有顯著性（F=74.414，P<0.01）。免疫印跡結果顯示，上述各細胞系中eIF4E蛋白相對表達量分別為3.483±0.025、2.675±0.038、2.038±0.019、1.635±0.039、1.000±0.027，各組比較差異有顯著性（F=1 981.243，P<0.01）。

2.2 A～D組細胞miR-429相對表達量比較

RT-qPCR結果顯示，A～D組細胞miR-429相對表達量分別為41.565±2.259、1.000±0.048、0.578±0.087、1.000±0.094，各組細胞miR-429相對表達量比較差異均具有顯著性（F=647.102，P<0.01）；其中A組較B組細胞miR-429相對表達量顯著增高（t=25.390，P<0.01），C組較D組細胞miR-429的相對表達量顯著降低（t=－4.652，P<0.05），說明轉染成功，可進行后續實驗。

2.3 A～D組細胞增殖活力比較

重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、組別、時間與組別交互作用對A、B組MCF-7細胞增殖活力均具有顯著的影響（F_時間=1 146.338，F_組別=39.809，F_{時間*組別}=14.510，P<0.01）。單獨效應分析結果顯示，A組細胞第0、24小時時的增殖活力相比，B組細胞第0、24小時時的增殖活力相比，差異均有顯著性（F=332.338、827.901，P<0.01）；培養至第24、48、72小時時，A組細胞增殖活力明顯低于B組（F=26.148～40.997，P<0.01）。重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、組別、時間與組別交互作用對C、D組MCF-7細胞增殖活力均具有明顯的影響（F_時間=682.353，F_組別=32.159，F_{時間*組別}=4.321，P<0.01）。單獨效應分析結果顯示，C組細胞第0、24小時時的增殖活力相比，D組細胞第0、24小時時的增殖活力相比，差異均具有顯著性（F=756.132、209.376，P<0.01）；培養至第24、48、72小時時，C組細胞的增殖活力較D組顯著性增強（F=6.410～82.593，P<0.05）。見表2。

2.4 A～D組細胞遷移能力比較

細胞劃痕實驗結果顯示，A～D組的細胞愈合率分別為16.497±0.419、31.806±0.862、39.293±0.715、31.428±0.656，各組細胞愈合率比較差異有顯著性（F=392.425，P<0.01）；其中A組細胞較B組細胞愈合率明顯降低（t=－22.584，P<0.01）；而C組細胞較D組細胞愈合率明顯增高（t=11.464，P<0.01）。見圖1。

2.5 E～H組細胞雙熒光素酶報告基因活性檢測

雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，E～H組細胞相對熒光素酶活性值分別為0.503±0.008、0.997±0.014、0.995±0.031、0.995±0.011，各組細胞相對熒光素酶活性比較差異均具有顯著性（F=366.823，P<0.05）；其中E組較F組細胞相對熒光素酶活性顯著性下調（t=－42.961，P<0.01），G組與H組細胞比較相對熒光素酶活性無顯著性變化（P>0.05）。

2.6 A～D組細胞eIF4E mRNA相對表達量比較

RT-qPCR法結果顯示，A～D組細胞eIF4E mRNA的相對表達量分別為0.304±0.050、1.000±0.144、1.727±0.328、1.000±0.126，各組細胞中eIF4E mRNA相對表達量比較差異有顯著性（F=18.342，P<0.01）；其中A組較B組細胞eIF4E mRNA的相對表達量顯著降低（t=－6.363，P<0.05），C組較D組細胞eIF4E mRNA的相對表達量顯著升高（t=－2.928，P<0.05）。

2.7 A～D組eIF4E蛋白相對表達量比較

免疫印跡結果顯示，A～D組細胞eIF4E蛋白相對表達量分別為0.309±0.012、1.000±0.046、1.166±0.058、1.000±0.028，各組細胞eIF4E蛋白相對表達量比較差異具有顯著性（F=178.306，P<0.01）；其中A組較B組細胞eIF4E蛋白相對表達量顯著降低（t=－20.355，P<0.01），C組較D細胞eIF4E蛋白的相對表達量顯著升高（t=3.622，P<0.05）。見圖2。

3 討論

乳腺癌是一種十分常見女性惡性腫瘤，目前其發病率呈逐年上升趨勢，因此發現并了解參與乳腺癌發生發展的可能基因位點，探討乳腺癌發生的分子機制，具有十分重要的意義^[11]。

miRNA通過與目的基因mRNA的3′UTR堿基互補配對結合，降解或抑制靶基因轉錄，從而抑制轉錄后蛋白質的翻譯，負性調節基因表達，影響癌細胞生物學功能^[2-3，12]。有研究發現，miR-429在多種腫瘤中存在表達并發揮調控作用。如miR-429在腎細胞癌^[13]、胰腺導管腺癌^[14]、子宮頸癌^[15]等腫瘤中呈低表達，可發揮抑癌基因作用；但在肺癌^[16]、前列腺癌^[17]、子宮內膜癌^[18]等腫瘤中呈高表達，發揮癌基因作用。目前相關的研究發現，miR-429可通過調控Bcl-2、LRP1、ZEB1/ZEB2等靶基因來參與細胞增殖^[4]、侵襲及上皮間質轉化等過程^[19]。

研究發現，eIF4E的過表達在體外可促進細胞的增殖和惡性轉化，在體內實驗中則可促進小鼠腫瘤的形成并增加腫瘤侵襲性^[20]。eIF4E作為正常的翻譯起始因子存在于所有正常細胞中，但在多種惡性腫瘤中被檢測到其高表達，因此eIF4E可能作為癌基因在腫瘤發病中起著重要作用^[21]。eIF4E表達水平與腫瘤的發生、進展和轉移等惡性生物學行為密切相關，elF4E表達升高時可以促進一部分eIF4E敏感性的基因（如c-Myc^[22]、VEGF^[23]以及MMP-9等）的出核和翻譯啟動，進而促進癌基因表達。eIF4E蛋白磷酸化在eIF4E致癌機制中起決定性的作用^[6]，eIF4E的磷酸化水平在多種腫瘤中升高并與腫瘤進展和預后相關。研究證實，磷酸化的eIF4E可以使腫瘤細胞獲得最大的侵襲和轉移潛能^[24-25]，轉移性腫瘤細胞中磷酸化eIF4E水平遠高于非侵襲性或非轉移性細胞^[26]。miR-429是否參與調控eIF4E磷酸化過程以及是否能夠調控磷酸化eIF4E蛋白參與腫瘤細胞惡性行為，有待進一步實驗驗證和探討。

本研究采用生物信息學方法預測miR-429與eIF4E靶向關系，結果顯示eIF4E基因3′UTR與miR-429存在互補配對的結合位點；E組細胞較F組細胞相對熒光素酶活性顯著下調，雙熒光素酶實驗表明miR-429與eIF4E間存在結合作用；A組細胞較B組細胞miR-429表達水平增高，細胞增殖及遷移能力被顯著抑制，eIF4E mRNA和蛋白表達水平顯著降低；而C組細胞較D組細胞miR-429表達被抑制，細胞增殖、遷移能力明顯增強，eIF4E mRNA和蛋白表達水平升高。故而證明miR-429通過靶向eIF4E調控乳腺癌的增殖、遷移能力，從而抑制乳腺癌的發生發展。miR-429與eIF4E基因3′UTR互補結合以實現調控作用，調控機制可能為miR-429抑制或降解eIF4E mRNA，進而抑制翻譯產生eIF4E蛋白，最終減少翻譯起始復合物的形成，影響基因5′UTR解旋，減少其他相關癌蛋白的合成。

綜上所述，miR-429可通過靶向調控eIF4E抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，從而抑制乳腺癌發生進展。生物信息學預測發現miR-429參與調控多個靶基因以及信號通路，其調控更多靶基因的機制以及eIF4E促癌的機制尚需進一步研究。

作者聲明：牛婷婷、侯琳、吳琍參與了研究設計；牛婷婷、吳琍、仇碧茹、趙曉暉、李全洋參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）