基于PiggyBac轉座系統(tǒng)的低溢漏誘導型Tet-On過表達體系的建立及應用

張柏權 李中瀚 殷旖珂

為避免誘導基因穩(wěn)定表達的Tet-On誘導表達系統(tǒng)溢漏表達，實現(xiàn)簡便且高效的外源基因穩(wěn)定誘導表達， 本研究擬在Tet-On調(diào)控的轉錄水平基礎上，將基于穩(wěn)定配體Shield-1的不穩(wěn)定結構域FK506結合蛋白引入目的基因的N端，從蛋白水平控制其本底表達水平.為驗證該系統(tǒng)的效果，本研究以熒光蛋白TdTomato為報告基因，經(jīng)流式分析結果證明優(yōu)化后的體系較原體系的溢漏表達在蛋白水平上降低7倍左右.將該系統(tǒng)應用于基于小鼠胚胎干細胞的體外牙向分化模型，在誘導因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1的協(xié)同作用下，誘導表達牙齒發(fā)育相關轉錄因子Hand2提高了牙向分化誘導的完成度.

PiggyBac轉座系統(tǒng)； Tet-on誘導型過表達系統(tǒng)； 溢漏表達； 不穩(wěn)定結構域； 穩(wěn)定配體Shield-1

Q28A2023.036004

收稿日期： 2022-08-15

基金項目： 國家自然科學基金青年基金（31900900）

作者簡介： 張柏權（1997-）， 男， 陜西西安人， 碩士研究生， 主要從事細胞生物學研究. E-mail： 248857314@qq.com

通訊作者： 殷旖珂．E-mail： ytyike@outlook.com

Establishment and application of a low-leakage Tet-On inducible overexpression system based on the PiggyBac transposition system

ZHANG Bai-Quan， LI Zhong-Han， YIN Yi-Ke

（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064）

In order to avoid the leakage expression of the Tet-on inducible expression system and to achieve easy， stable and efficient expression of exogenous gene when induced at a specific time， this study planned to add the destabilizing domain FK506-binding protein， regulated by the stable ligand Shield-1， to the N-terminal of the target gene to control its background expression at the protein level. To verify the performance of this system， the fluorescent protein TdTomato was used as the reporter gene in this study. The results of flow analysis showed that the leakage expression in the optimized system was reduced about 7 times compared with the original one at the protein level. This system was applied to the in vitro odontogenic induction system based on mouse embryonic stem cells. Under the synergistic effect of the inducible factor Dox and the stable ligand Shield-1， the induced overexpression of tooth development-related transcription factor Hand2 could improve the completion of odontogenic induction.

PiggyBac transposition system; Tet-On inducible overexpression system; Leakage expression; Destabilizing domain; Stable ligand Shield-1

1 引 言

在發(fā)育生物學中，某些關鍵基因在特定時間段的表達，是實現(xiàn)體外組織器官再生的關鍵步驟，利用Cre-loxP、Tet-On等系統(tǒng)可在體外實現(xiàn)特定基因的定時表達［1-4］.其中，Cre-loxP系統(tǒng)實現(xiàn)對目的基因表達開啟是不可逆的［2， 5］.而Tet-On系統(tǒng)憑借其添加或去除誘導因子Dox實現(xiàn)目的基因表達起始或停止這一優(yōu)勢，而被廣泛使用［3， 6］.通常情況下，在Tet-On過表達系統(tǒng)中，持續(xù)表達的rtTA處于游離狀態(tài)，不會結合誘導型tetO啟動子，無法起始目標基因的表達；而在添加了四環(huán)素誘導因子（Doxycycline， Dox）后，Dox結合rtTA并改變其構象，使其結合于tetO啟動子上，進而起始目標基因的表達［6， 7］.如添加誘導因子Dox實現(xiàn)基于Tet-On系統(tǒng)的轉錄因子Nanog的過表達，進而實現(xiàn)對原始生殖細胞（Primordial germ cells）的分化誘導［4］.

慢病毒感染或PiggyBac轉座系統(tǒng)可以實現(xiàn)外源基因穩(wěn)定整合與表達［8， 9］.其中慢病毒感染包含慢病毒生產(chǎn)這一關鍵步驟，耗時長［8］.而步驟簡單，操作便利的PiggyBac轉座系統(tǒng)，僅需將轉座酶PBase與包含目的基因的載體共同轉染進目標細胞群，即可通過轉座酶PBase高效且穩(wěn)定地將位于反向末端重復序列（inverted terminal repeats sequences， ITRs）間的目的片段，以“剪切-粘貼”的方式，整合至基因組的TTAA序列之間，實現(xiàn)基因片段的穩(wěn)定插入［9， 10］，如通過PiggyBac轉座系統(tǒng)實現(xiàn)Nanog表達元件在細胞基因組中的整合［4］.因此，基于PiggyBac轉座系統(tǒng)的Tet-On誘導型過表達系統(tǒng)，可以方便快捷的構建研究目的基因的體外細胞模型，且在誘導因子Dox存在時，可以穩(wěn)定地起始目的基因的過表達［3， 6， 7］.

然而，該系統(tǒng)也存在一定的缺點.即在沒有誘導因子Dox存在時，處于靜息狀態(tài)的系統(tǒng)，仍有少量目的基因的表達，該現(xiàn)象稱之為溢漏（leakage）［3， 7］，而該現(xiàn)象可能會對體外分化造成嚴重影響.為了減少溢漏現(xiàn)象，并增強體系的精確度，本研究擬在目的基因的N端引入不穩(wěn)定結構域（destabilizing domain， DD），即含F(xiàn)36V和L106P突變的FK506結合蛋白（FK506 binding protein， FKBP），其與穩(wěn)定配體（stabilizing ligand）Shield-1具有更高的結合穩(wěn)定性［11］.添加不穩(wěn)定結構域后，在缺乏誘導因子Dox時，系統(tǒng)溢漏表達的mRNA經(jīng)核糖體翻譯后，形成攜帶FKBP的融合蛋白，該蛋白在缺乏其穩(wěn)定配體時Shield-1時，會處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，從而經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system）途徑快速降解，實現(xiàn)系統(tǒng)溢漏表達在蛋白水平的降低.因此，當添加誘導因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1時，Dox將起始融合蛋白的mRNA的轉錄，穩(wěn)定配體Shield-1結合翻譯后的融合蛋白使其處于穩(wěn)定狀態(tài)，進而發(fā)揮其生物學功能［11-13］.

人的牙齒不具有再生能力，牙齒再生有望實現(xiàn)牙齒生理功能的全面恢復 ［14］.現(xiàn)階段，尚無基于小鼠胚胎干細胞體外從頭再生的先例.受過表達轉錄因子Sox9和Foxc1可以在體外再生唾液腺的啟發(fā)［15］，本研究擬通過優(yōu)化后的誘導型過表達體系，過表達牙齒發(fā)育相關轉錄因子，探究其對于牙向分化誘導的作用.在脊椎動物中，Hand2在顱面部神經(jīng)嵴發(fā)育至下頜過程的間充質細胞中表達，并決定下頜的發(fā)育命運［16-18］，在神經(jīng)嵴中，Hand2基因突變將影響下頜以及相關結構的發(fā)育［17］，過表達Hand2將改變上頜的發(fā)育命運，使之獲得下頜的發(fā)育命運［16］.本實驗室RNA-seq數(shù)據(jù)分析顯示胚胎發(fā)育E10.5天的牙胚的間充質細胞中，Hand2呈現(xiàn)高表達的狀態(tài).然而從本實驗室建立的小鼠胚胎干細胞體外牙向分化數(shù)據(jù)分析，Hand2的表達水平較低.因此，本研究擬結合上述誘導表達系統(tǒng)，將Hand2作為目標基因，探究該系統(tǒng)的應用前景并及Hand2對于牙向分化誘導的作用.

綜上，本文優(yōu)化了現(xiàn)有的基于PiggyBac轉座系統(tǒng)的Tet-On誘導型過表達系統(tǒng)，并證明在目的基因的N端添加不穩(wěn)定結構域后，以TdTomato熒光蛋白為報告基因，在無誘導因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1時，體系的溢漏表達在蛋白水平上降低7倍左右；且在誘導因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1的協(xié)同作用下，可以實現(xiàn)熒光蛋白TdTomato的穩(wěn)定過表達；并且，將該體系應用在基于小鼠胚胎干細胞的體外分化模型中，擬胚體分化的第8～12 d，添加Dox和Shield-1可以提高轉錄因子Hand2和下游靶基因Pitx1的表達程度［16］，Pitx1在胚胎發(fā)育過程中，是擬發(fā)育成牙上皮的細胞群的標志基因之一［19］，證明過表達Hand2可以提高牙向分化誘導的完成度.本文首次實現(xiàn)基于PiggyBac轉座系統(tǒng)，通過不穩(wěn)定結構域降低溢漏表達的Tet-On誘導型過表達系統(tǒng)的建立.該系統(tǒng)為解析發(fā)育過程中的重要事件提供了高效且精確的研究手段，也為研究特定基因在發(fā)育過程中如何指導細胞命運和分化決策提供重要方法.

2 材料和方法

2.1 材 料

小鼠原代胚胎干細胞單克隆細胞系6#-13，E.coli HST08 Competent Cells（Takara，9128），DMEM basic（Gibco，C11995500BT），F(xiàn)etal Bovine Serum（Hyclone，SH30396.03），GlutaMAX（Gibco，335050-061），MEM NEAA（Gibco，11140-050），Pen-Strep（Gibco，15140-122），Recombination Human Lif（Novoprotein，C017），β-Mercaptoethanol（Gibco，M3148），Trizol（Sigma，T9424），氯仿（成都長聯(lián)化工，XK13-201-00213-016），異丙醇（Fisher chemical，A451），質粒小提試劑盒（TIANGEN，DP103），反轉錄試劑盒（TAKARA，RR047A），PBS（Gibco，C10010500BT），Gelatin from porcine skin（Sigma，G1890-100G），Lipofectamine 3000 Transfection Kit（Invitrogen，L3000-015），Dox（TAKARA，631311），Shield-1（MCE，HY-112210），0.25% Trypsin-EDTA（Gibco，25200072），ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（諾唯贊，C113）

2.2 方 法

2.2.1 載體構建 本實驗室提供基于PiggyBac轉座系統(tǒng)的Tet-On過表達TdTomato的質粒，PiggyBac-Tet-On-TdTomato，并攜帶Puro抗性基因.提取小鼠E10.5的牙胚的RNA并通過反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，使用高保真酶擴增出Hand2序列.以HEK293FT細胞的基因組為模板，使用高保真酶擴增出DD序列.通過ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，以同源重組的方式完成載體PiggyBac-Tet-On-DD-TdTomato和PiggyBac-Tet-On-DD-Hand2的構建.隨后進行轉化、涂板、菌落PCR鑒定、搖菌、提質粒、測序等操作獲得目的質粒.

2.2.2 細胞培養(yǎng) 配置維持6#-13細胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基，配方為409.45 mL DMEM，75 mL FBS，5 mL Pen-Strep，5 mL GlutaMAX，5 mL NEAA， 500 μL β-Mercaptoethanol和50 μL Lif.傳代過程為：0.1%的gelatin處理培養(yǎng)板20 min；棄培養(yǎng)基，添加胰酶，37 ℃消化3 min，ES培養(yǎng)基中和，1500 r/min離心3 min后棄上清，使用ES培養(yǎng)基重懸細胞，按合適比例傳代至處理后的細胞培養(yǎng)板中，并補充ES培養(yǎng)基至2 mL，隨后將細胞培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).Dox的工作濃度為1μg/mL.觀察細胞熒光表達情況的曝光時間為100ms（-Dox）和5ms（+Dox）.

2.2.3 細胞轉染 質粒的轉染使用Lipo3000轉染試劑盒，按照說明書進行操作，其中空載質粒、質粒PiggyBac-Tet-On-DD-Hand2、質粒PiggyBac-Tet-On-DD-TdTomato或質粒PiggyBac-Tet-On-TdTomato分別與PiggyBac轉座酶PBase進行轉染，且質粒的摩爾比為1∶1.轉染兩天后的細胞群開始藥篩，每1 mL培養(yǎng)基加入0.1 μL濃度為10 mg/mL的Puromycin.藥篩傳代3次后，獲得穩(wěn)定的細胞系，進行細胞凍存，并用于后續(xù)的實驗

2.2.4 熒光定量 RNA的提取按照Trizol法進行操作，提取后的RNA使用NanoDrop檢測濃度，做好標記，置于-80 ℃冰箱保存；反轉錄使用Takara反轉錄試劑盒，并按照說明書的步驟進行操作.完成反轉錄的cDNA添加無DNase的水進行稀釋，置于-20 ℃冰箱保存；根據(jù)需要合成qPCR實驗所需的引物；實驗體系參考Vazyme的SYBR qPCR Master Mix的說明書進行配置，并進行實驗，GAPDH為內(nèi)參.

qPCR引物：

GAPDH F：GCACAGTCAAGGCCGAGAAT

GAPDH R：GCCTTCTCCATGGTGGTGAA

TdTomato F：GTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAG

TdTomato R：CTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGTACAGGA

Hand2 F：CCGACACCAAACTCTCCAA

Hand2 R：GATCCATGAGGTAGGCGATG

Pax9 F：CTCCATCACCGACCAAGG

Pax9 R：CCCTTCTCCAATCCATTCAC

Lhx8 F：GAAGTGGAGAACGGTAATGGG

Lhx8 R：TGTTGTCCTGAGCGAACTGT

Pitx1 F：ACTCCTACAACAACTGGGCG

Pitx1 R：GGGCCGAGAACATGGATTGA

2.2.5 流式分析 收集樣品于15mL離心管中，用PBS洗3次，隨后加入0.25%的Trypsin-EDTA消化5 min，用移液器吹打至散開，隨后再37 ℃消化2 min，加入3倍體積的培養(yǎng)基中和胰酶，并加入適量DNase，吹打至無細胞團，500 g離心3 min，去上清，用PBS重懸細胞并用細胞篩過濾至流式管中.流式細胞儀按照說明書的指示調(diào)整至正常工作狀態(tài)，并進行實驗.

3 結果與分析

3.1 誘導型過表達載體的優(yōu)化原理和應用方法

基于PiggyBac轉座系統(tǒng)的Tet-On誘導型過表達系統(tǒng)，在沒有誘導因子Dox的存在下，誘導型啟動子仍能起始目的基因（gene of interests，GOI）的表達，這種現(xiàn)象稱為溢漏（leakage）［3， 7］.為降低系統(tǒng)的溢漏，本研究擬在目的基因的N端的引入不穩(wěn)定結構域，即FK506結合蛋白，使新的目的基因表達元件經(jīng)核糖體翻譯后，形成融合蛋白.理論上，優(yōu)化后的系統(tǒng)有兩種工作狀態(tài)：一，在無誘導因子和穩(wěn)定配體存在時，溢漏表達的融合蛋白因攜帶不穩(wěn)定結構域會經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑被快速降解；二，在誘導因子Dox和穩(wěn)定配體Shield-1同時存在時，系統(tǒng)可以穩(wěn)定的過表達融合蛋白，不被降解，進而發(fā)揮其生物學功能，如圖1a所示.而該系統(tǒng)通過轉座酶（PBase）識別誘導型過表達系統(tǒng)（inducible overexpression system，IOS）兩端的反向末端重復序列（inverted terminal repeats，ITR），并將其穩(wěn)定整合于細胞基因組中，后經(jīng)藥物篩選，可獲得包含穩(wěn)定整合誘導型過表達系統(tǒng)的細胞群，用于后續(xù)實驗，如圖1b所示.

3.2 不穩(wěn)定結構域顯著降低誘導型過表達系統(tǒng)的溢漏表達

本研究基于小鼠原代胚胎干細胞株6#-13，分別構建轉染空載（空白對照組）、PiggyBac-Tet-On-TdTomato（對照組）或PiggyBac-Tet-On-DD-TdTomato（實驗組）的細胞群，后經(jīng)藥物篩選，獲得穩(wěn)定整合誘導型過表達系統(tǒng)的細胞群.細胞群在培養(yǎng)24 h后，通過熒光顯微鏡觀察其熒光蛋白表達情況.同等曝光時間下，不添加誘導因子Dox時，實驗組較對照組熒光信號低，證明不穩(wěn)定結構域DD可以降低系統(tǒng)的溢漏表達，如圖2a所示；同等曝光時間下，在添加誘導因子Dox時，實驗組較對照組熒光信號低，證明體系雖過表達融合蛋白，但大部分融合蛋白被迅速降解，如圖2b所示；RT-qPCR結果顯示，無論是否存在誘導因子Dox，實驗組的TdTomato在mRNA表達水平上，始終低于對照組五倍左右，如圖2c所示.因此，不穩(wěn)定結構域不影響體系目的基因在mRNA水平上的表達.流式分析結果顯示，實驗組較對照組的TdTomato在蛋白水平上表達差異較大，溢漏表達降低7倍左右，如圖2d所示.其中，空白對照組始終無熒光信號.以上實驗結果均顯示不穩(wěn)定結構域的引入，能夠大幅度從蛋白水平上降低系統(tǒng)的溢漏現(xiàn)象.

3.3 穩(wěn)定配體 Shield-1可以恢復目的蛋白的穩(wěn)定過表達

本研究在細胞的培養(yǎng)過程中加入相同濃度的誘導因子Dox和不同濃度的穩(wěn)定配體Shield-1，以恢復含不穩(wěn)定結構域（DD）的融合蛋白的穩(wěn)定過表達.細胞在傳代24 h后，通過熒光顯微鏡觀察其熒光蛋白表達情況.在相同曝光時間下，實驗組TdTomato的熒光信號隨著Shield-1的濃度增加而逐漸變強，而對照組TdTomato的熒光信號不隨Shield-1的濃度改變，證明優(yōu)化后的體系，具有依賴于穩(wěn)定配體Shield-1濃度的蛋白穩(wěn)定表達的特征，如圖3a所示；流式分析的結果證明，500 nmol/L的Shield-1足以恢復實驗組的TdTomato在蛋白水平上的穩(wěn)定表達，已達到TdTomato穩(wěn)定表達的閾值，如圖3b所示.其中，空白對照組始終無熒光信號.綜上，經(jīng)優(yōu)化后的體系可以在Dox和Shield-1的協(xié)同作用下，過表達目的基因.

3.4 過表達轉錄因子Hand2可以提高牙向分化誘導的完成度

為了探究轉錄因子Hand2對牙向分化誘導的作用，本研究構建了穩(wěn)定表達PiggyBac-Tet-On-DD-Hand2的6#-13細胞群，稱為6#-13（Hand2 OE）（OE， overexpression），如圖4a所示.添加誘導因子Dox可以實現(xiàn)Hand2在mRNA水平上的過表達，如圖4b所示.由于牙齒發(fā)育需牙上皮細胞和牙間充質細胞協(xié)同作用［20， 21］，故分化體系內(nèi)，只需部分細胞過表達轉錄因子Hand2，因此，我們將未經(jīng)過轉染的6#-13細胞群（對照組）與6#-13（Hand2 OE）細胞群按數(shù)量比1∶1混合，形成6#-13（Hand2 OE + WT） （WT， wild type）（實驗組），并采用圖4c所示的實驗方案開展實驗，即在體外分化的8～12 d，添加Dox和Shield-1起始Hand2的穩(wěn)定過表達.經(jīng)體外牙向誘導分化處理，實驗組與對照組形成的擬胚體在外觀上基本無差異，均為表面光滑的球體，如圖4d所示.收集第12 d的擬胚體并抽提RNA，經(jīng)RT-qPCR，證明實驗組較對照組，實現(xiàn)了轉錄因子Hand2在RNA水平和蛋白水平上的過表達，其中，Hand2在蛋白水平上的過表達反映為其下游靶基因Pitx1的RNA表達水平提升，如圖4e所示.本實驗室建立的小鼠胚胎干細胞體外牙向分化數(shù)據(jù)分析顯示，作為牙上皮細胞的標志基因之一的Pitx1表達量較低［19］.在小鼠牙胚發(fā)育過程中，表達Pax9和Lhx8的細胞將擬發(fā)育成牙間充質細胞［19］，由實驗結果可知，實驗組依然維持高水平的Pax9和Lhx8的表達，如圖4e所示，證明優(yōu)化后的過表達體系不會對原有的牙向分化體系產(chǎn)生影響.綜上，我們認為，優(yōu)化后的誘導型過表達體系可以成功應用于，基于小鼠胚胎干細胞的體外分化模型的研究，且過表達轉錄因子Hand2可以提高了體外牙向分化誘導的完成度.

4 討 論

PiggyBac轉座系統(tǒng)可以高效、快捷地構建穩(wěn)定整合外源基因片段的細胞群，Tet-On誘導型過表達系統(tǒng)則可以在特定時間，通過添加誘導因子Dox實現(xiàn)目的基因的過表達，并發(fā)揮其作用，去掉誘導因子Dox的12～24 h內(nèi)，目的基因的過表達會被關閉，系統(tǒng)恢復靜息狀態(tài)［3］.無論是細胞分化模型還是疾病模型，基于該系統(tǒng)建立的研究體系均有良好的表現(xiàn)，為研究某一基因的功能及其相關的基因調(diào)控網(wǎng)絡提供重要的研究手段［4， 6］.但是，該系統(tǒng)存在的溢漏表達，使得基于此系統(tǒng)產(chǎn)生的實驗結果的準確度降低，故大量文獻嘗試對包含不同氨基酸突變的誘導型過表達系統(tǒng)進行測試，尋找低溢漏表達的誘導型系統(tǒng)［7］.本文通過在目的基因N端引入不穩(wěn)定結構域，欲從蛋白水平上降低誘導型過表達體系溢漏表達.由TdTomato熒光報告蛋白的實驗結果來看，不穩(wěn)定結構域的引入，能夠大幅度從蛋白水平上降低系統(tǒng)的溢漏現(xiàn)象，因此，該系統(tǒng)對于目的基因的表達控制更加精準，具有更高的應用價值. 為進一步研究該系統(tǒng)在實際中的應用，本研究在基于小鼠胚胎干細胞的體外牙向分化誘導體系中，探究了轉錄因子Hand2對牙向分化的誘導作用.由于Hand2也可以促進中胚層來源的心臟的發(fā)育［18］，基于低溢漏表達的誘導型過表達體系，可以避免Hand2在擬胚體的外胚層發(fā)育誘導過程（day0-day8）中的潛在影響.利用該系統(tǒng)，過表達轉錄因子Hand2使擬胚體在原分化體系的基礎上，實現(xiàn)了更多的牙齒發(fā)育相關基因的高表達，使其更貼近于小鼠原代牙胚相關基因的表達趨勢.原分化體系其他低表達的牙齒發(fā)育相關基因可以通過該體系實現(xiàn)基因的高表達，富集多種牙齒發(fā)育相關基因的擬胚體有望首次實現(xiàn)小鼠牙齒的體外從頭再生.在體外發(fā)育生物學研究過程中，多數(shù)情況下，需要嚴格控制目的基因只在特定的時期進行表達，因此，低溢漏表達的誘導型過表達體系的建立十分必要，基于該體系產(chǎn)生的實驗結果具有更高的可信度.

本文將不穩(wěn)定結構域FKBP蛋白引入基于PiggyBac轉座系統(tǒng)的誘導型Tet-On過表達體系，建立了低溢漏表達的誘導型過表達體系，一定程度上提高了系統(tǒng)的準確度，基于該系統(tǒng)所做的研究產(chǎn)生的成果也將更有說服力.對優(yōu)化的誘導型表達體系的合理應用，可以加速對發(fā)育生物學研究中重要事件的解析，也為疾病模型、分化模型等研究提供了重要的手段，推動干細胞研究向臨床應用方面的轉化.

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引用本文格式：

中 文：? 張柏權， 李中瀚， 殷旖珂. 基于PiggyBac轉座系統(tǒng)的低溢漏誘導型Tet-On過表達體系的建立及應用［J］. 四川大學學報：? 自然科學版， 2023， 60：? 036004.

英 文：? Zhang B Q， Li Z H， Yin Y K. Establishment and application of a low-leakage Tet-On inducible overexpression system based on the PiggyBac transposition system ［J］. J Sichuan Univ：? Nat Sci Ed， 2023， 60：? 036004.