3種微藻對海水集約化對蝦養殖尾水氮磷的去除效果

潘志恒　魯敏　曹煜成　徐煜　徐武杰　胡曉娟　蘇浩昌　文國樑

摘要：基于對蝦生物絮團集約化養殖尾水含有高濃度硝態氮和磷酸鹽的特征，比較分析鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）、鹽藻（Dunaliella sp.）3種微藻在配制尾水中的存活生長狀況及其對無機氮磷的去除效果，以期篩選出適宜的微藻用于后續尾水凈化技術。采用顯微鏡計數法測定藻細胞密度，國標法測定總無機氮、氨氮、硝態氮、亞硝態氮和磷酸鹽的含量。結果顯示，鈍頂螺旋藻在試驗前后的藻細胞密度變化不大（P>0.05），約為3.32×106 個/mL和5.88×106 個/mL；牟氏角毛藻和鹽藻細胞密度有明顯增加（P<0.05），分別從初始的4.00×104 個/mL和2.50×105 個/mL升高至試驗結束時的1.66×106 個/mL和1.06×107 個/mL。經過16 d試驗，鈍頂螺旋藻組對硝態氮和總無機氮去除率分別為79.60%和46.06%，顯著高于其他各組（P<0.05），第8天時對磷酸鹽的去除率可高達98.55%；牟氏角毛藻組16 d的磷酸鹽去除率為98.25%，顯著高于其他各組（P<0.05）。研究表明，3種微藻均可在對蝦養殖尾水環境中存活，且對尾水氮磷具有較好的凈化效果。

關鍵詞：養殖尾水；鈍頂螺旋藻；牟氏角毛藻；鹽藻；氮磷營養鹽

中圖分類號：X506? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2023）05-0149-07

水產品已經成為我國重要的蛋白質來源之一，根據《2021中國漁業統計年鑒》，2020年全國水產品總產量為6 549萬t，其中養殖產量占總產量的79.8%，表明水產養殖已成為水產品供給的最主要途徑。生物絮團技術（Biofloc technology， BFT）可以利用水體中硝化菌的硝化作用將養殖水體中有害的氨氮和亞硝態氮轉化成相對無害的硝態氮，控制其含量在較低范圍（Ray et al，2010；徐武杰，2014）；同時，BFT養殖模式還可為養殖對象提供餌料蛋白源并提高飼料利用率（羅婉儀等，2021）。然而，隨著BFT集約化養殖到中后期，水體富集大量硝態氮和磷酸鹽（范鵬程等，2019）；在凡納濱對蝦精養模式中，高達95%的磷輸入來自飼料投放（王申等，2018）。如果含有大量無機氮磷的養殖尾水直接排放勢，必將對周邊水域生態環境造成不良影響（劉慶輝等，2019）。生物處理集約化養殖尾水相較于物理法、化學法具有成本低、效率高、不易形成二次污染等優點。運用生態學技術高效去除養殖尾水中富集的氮磷，可以避免其直接排放造成的環境富營養化問題。

微藻生長繁殖快、易于培養，且對環境有較強適應能力（劉磊等，2014）。目前已有不少利用微藻處理養殖尾水的相關報道（Guo et al，2013；Ansari et al，2017；劉盼等，2018；劉慶輝等，2021）。鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）對水體鹽度的適應范圍廣，可在海水中生長存活（劉婷，2018）；牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）細胞個體不大，容易形成藻細胞群體，可在25～35 ℃的沿岸半咸水環境下迅速繁殖（金彬明和曾國權，2004）；鹽藻（Dunaliella sp. ）細胞適鹽范圍廣，可在接近淡水 （<0.1 mol/L） 甚至飽和鹽水 （>5 mol/L）環境中生存。有研究表明，鈍頂螺旋藻、鹽藻和牟氏角毛藻凈化處理一般的養殖尾水均可達到較好效果（葉志娟，2006；葉志娟等，2006；胡海燕，2007；慧敏，2013）。微藻對養殖尾水氮磷去除的潛力巨大，但此前的研究水體大多為較低氮磷濃度的尾水（劉林林等，2014；劉梅等，2018）；而在高濃度硝態氮、磷酸鹽的集約化養殖尾水中，鮮見微藻生長生存潛力及其對高密度氮、磷凈化效果的研究。本研究通過比較3種不同門類的微藻在BFT集約化養殖尾水中的生長狀況及對高濃度無機氮磷的去除效果，篩選出效果較優的微藻，可為后續提升集約化養殖尾水處理技術，實現生物凈化及資源再利用提供數據支撐。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

試驗所用的鈍頂螺旋藻、牟氏角毛藻和鹽藻均由中國水產科學研究院南海水產研究所提供。

BFT養殖尾水取自廣東省陸豐市某養殖場的凡納濱對蝦BFT零換水養殖系統（1 000 m3）；該系統中放養體長10 mm的蝦苗，密度為650 尾/m3；養殖水溫31.1℃、鹽度20、溶解氧4.48 mg/L、pH 7.35、生物絮團沉降體積為10.5 mL/L。試驗用BFT采自集約化養殖58 d的尾水，試驗設置為4組，分別為鈍頂螺旋藻組（SP）、鹽藻組（DU）、牟氏角毛藻組（CM）和對照組（CK）；初始氮磷濃度見表1。試驗前將養殖尾水過濾滅菌處理，然后用過濾滅菌的天然海水、磷酸二氫鉀溶液將養殖尾水中的硝態氮濃度調至122～132 mg/L，磷酸鹽濃度調至約10 mg/L，使試驗水體中的無機氮磷比（N：P）約為13：1。

1.2? ?試驗步驟

分別在調配后的3種BFT養殖尾水中接入適當濃度的微藻，對照組不接藻。每組設3個平行，試驗體積80 mL，水體鹽度為20。參考相關文獻（葉志娟2006；胡海燕，2007；謝麗娟，2019），將3種微藻的初始接種濃度分別設為鈍頂螺旋藻3.32×106 個/mL、鹽藻2.50×105 個/mL、牟氏角毛藻4.00×104 個/mL。藻液在加入試驗瓶之前使用無菌生理鹽水對藻細胞進行振蕩清洗，4 000 g離心5 min，棄上清液，重復清洗3次。

試驗開始后，將錐形瓶置于恒溫光照培養箱內培養，溫度為（25±1）℃，光照強度2 500～3 000 lx，光暗周期12 h：12 h；每天6：00、12：00、18：00手搖混勻藻液3次，避免藻細胞貼壁生長，并隨機更換錐形瓶的位置，試驗時長為16 d。

1.3? ?微藻測定

于第0天和第16天從各試驗瓶中采集微藻樣品1 mL，并加入40 ?L甲醛固定，4℃保存。鹽藻、牟氏角毛藻直接使用血球計數板在光學顯微鏡下對其進行觀察計數。鈍頂螺旋藻細胞培養過程中易形成長鏈條狀群體，檢測前先將藻液進行超聲破碎，形成為小段狀，再取100 ?L藻樣在顯微鏡下用目微尺測定微藻群體及單個細胞的長度，然后計算藻細胞數量（王少沛等，2009）。每個樣品測量3次取平均值。

1.4? ?氮磷營養鹽測定

于第0、2、4、6、8、16天分別從各試驗組錐形瓶中取適當水樣進行過濾稀釋處理，參照國家標準（GB/T17378.4-2007），分別采用鋅鎘還原法、鹽酸萘乙二胺分光光度法、靛酚藍分光光度法和磷鉬藍分光光度法檢測水體中硝態氮、亞硝態氮、氨氮、磷酸鹽濃度；總無機氮濃度為硝態氮、亞硝態氮、氨氮濃度之和（曹煜成等，2017）。

1.5? ?數據統計

各組水質氮磷營養鹽指標去除率計算公式如下：

R = （C0-Ct） /C0×100% ①

式中：R為去除率（%），C0為初始濃度（mg/L），Ct為取樣測定濃度（mg/L）。

采用SPSS 26軟件對數據進行單因素方差分析（ANOVA），并用Duncans法檢驗各試驗組間差異顯著性，顯著水平設為P<0.05。

2? ?結果與分析

2.1? ?微藻數量變化

3種微藻在BFT尾水中的數量變化如表2所示。試驗結束時，鈍頂螺旋藻的數量上升但無顯著差異（P>0.05），鹽藻組和牟氏角毛藻的細胞數量明顯增加（P<0.05）。

2.2? ?氮磷去除效果

試驗期間，對照組中的各項氮磷指標除了氨氮濃度顯著升高外（P<0.05），其他水質指標均無顯著變化（P>0.05），表明3種微藻對養殖尾水中氮磷去除效果良好（圖1，表3，表4）。

從氮磷濃度變化來看，SP組、DU組和CM組的總無機氮濃度總體呈下降趨勢，分別由第0天的130.85、136.70、122.47 mg/L顯著下降至70.52、119.78、90.89 mg/L（P<0.05）。其中SP組總無機氮濃度降幅最大，去除量達到60.33 mg/L （圖1-a）。

試驗結束時，DU組的氨氮濃度由起始3.38 mg/L下降至0.16 mg/L，差異顯著（P<0.05），SP組和CM組的氨氮濃度始終保持在0.5 mg/L以下，各藻組氨氮的終濃度都較低，而對照組氨氮濃度由初期的1.48 mg/L上升到3.65 mg/L（圖1-b）。

SP組、DU組和CM組的硝態氮濃度降低顯著（P<0.05），由第0天的130.40、132.76、122.05 mg/L分別下降至26.65、118.31、89.27 mg/L（圖1-c）。

SP組和CM組的亞硝態氮濃度隨著試驗進行逐漸上升，第16天分別為43.54 mg/L和1.49 mg/L，且差異顯著（P<0.05），而DU組和對照組的亞硝態氮濃度全程均低于2.00 mg/L，無明顯變化（P>0.05）（圖1-d）。

3個微藻組的磷酸鹽濃度均有不同程度的降低，試驗結束時SP組、DU組和CM組分別由第0天的10.23、11.78、9.65 mg/L顯著下降至4.33、6.75、0.17 mg/L（P<0.05），其中SP組在試驗前期對磷酸鹽的去除速率更高（圖1-e）。

由表3和表4可見，就尾水中的氮磷去除率而言，SP組、DU組和CM組在試驗第8～16天對總無機氮去除率逐漸上升，其中SP組在第16天時的去除率最高，達到46.06%，顯著高于DU組和CM組（P<0.05），而CM組的總無機氮去除率顯著高于DU組（P<0.05）。第8天時SP組氨氮的去除率達到97.31%，DU組為90.88%，均顯著高于CM組的33.32%（P<0.05）；此后DU組和CM組的氨氮去除率逐漸升高，至第16天時分別達到95.12%和69.09%。3種微藻對硝態氮的去除率差異顯著（P<0.05），第16天時SP組、DU組和CM組的硝態氮去除率分別是79.60%、10.75%和28.58%；其中，鈍頂螺旋藻對硝態氮的去除率顯著高于其他2種微藻（P<0.05）。第8天時SP組的磷酸鹽去除率達到98.55%，顯著高于DU組的9.80%和CM組的87.28%（P<0.05），第16天時DU組的去除率上升至42.64%，CM組則上升至98.25%。

3? ?討論

3.1? ?微藻處理集約化養殖尾水的優勢

在當前處理集約化養殖尾水氮磷的方法中，生物凈化法具有不可比擬的優勢，其利用各種生物（植物、動物和微生物等）吸收、降解或轉化尾水中的污染物，可以讓養殖尾水系統循環呈現正循環，更加徹底有效地凈化養殖尾水（徐武杰等，2020）。生態處理法作為一種生物凈化方式，運用了生態學原理，以物質循環為基礎來吸收凈化養殖尾水中的氮磷營養鹽。尾水生態處理不僅適用于淡水養殖，也適用于海水養殖，但與淡水養殖尾水處理相比，可供選擇的海水尾水氮磷凈化植物較少，其中微藻是第一選擇。與其他凈水生物相比，微藻具有個體小、生長速度快、高效吸收尾水中氮磷可溶性營養鹽并具有附加效益等優點；同時，利用微藻自身特性處理養殖尾水中的氮磷營養鹽，還具有生態修復的良好效果（胡海燕等，2009；劉梅等，2018；龐昊，2021）。藍藻門的鈍頂螺旋藻、硅藻門的牟氏角毛藻和綠藻門的鹽藻常作為水產養殖動物的餌料和飼料添加劑，是養殖水體中常見的微藻，具備對養殖生物無害、高效吸收氮磷、易收取等優點，并且還有較高營養和經濟研究價值（Félix et al，2017;于宗赫等，2021;張新明等，2021;El-Araby et al，2022）。

3.2? ?微藻在BFT養殖尾水中的密度變化

微藻對水體中氮磷營養鹽的去除是通過吸收水體無機氮磷轉化為微藻細胞有機氮磷來實現，所以其在尾水中的生長繁殖狀態直接影響水體氮磷營養鹽的去除效果。從鈍頂螺旋藻、鹽藻和牟氏角毛藻在集約化養殖尾水中的生長繁殖情況來看，鈍頂螺旋藻從試驗初始的3.32×106 個/L至試驗結束增長為5.88×106 個/L，試驗前后微藻數量無顯著差異（P>0.05）；相比試驗前后的鹽藻和牟氏角毛藻，均增長了2個數量級，差異顯著（P<0.05）。分析鈍頂螺旋藻數量增加不顯著的原因，可能是由于螺旋初始藻密度較高，降低了培養液的透光率，從而導致光合作用變弱，致使生長繁殖不顯著（Cheirsilp & Torpee，2012）；也有可能是前期優先利用氨氮，第8天時的去除率已達97.31%，從而抑制其吸收利用硝態氮，同時磷酸鹽濃度也消減快速，在第2天時的去除率達到了97.0%，一定程度上限制了螺旋藻的生長繁殖（張誠和鄒景忠，1997）。磷元素的缺乏在一定程度上也限制了螺旋藻的生長繁殖，從而導致其細胞大量死亡，造成了培養液中磷酸鹽、氨氮和亞硝酸鹽氮濃度上升；而鹽藻和牟氏角毛藻試驗前后的藻量增加顯著，與張揚等（2011）的試驗結果顯著性相似。本次試驗結果表明，3種微藻在集約化養殖尾水中均可較好地存活，并可保持較高的細胞密度。

3.3? ?不同微藻對氮磷的凈化效果比較

鈍頂螺旋藻雖多見于淡水環境中，但近年來也有其相關的馴化試驗。邵營澤等（2005）研究發現，馴化后的鈍頂螺旋藻可在鹽度10～40的環境中良好生長。本研究結果顯示，鈍頂螺旋藻在鹽度20的養殖尾水環境中可以生長存活。也有利用鈍頂螺旋藻凈化廢水和污水的相關報道，張燕鵬（2020）利用糖蜜發酵廢水培養鈍頂螺旋藻，發現廢水中硝態氮和磷酸鹽濃度從215 mg/L和23 mg/L分別下降了94.7 mg/L和18.1 mg/L，與本研究中鈍頂螺旋藻對養殖尾水中硝態氮、磷酸鹽吸收值相近。胡海燕（2007）利用螺旋藻凈化海水養殖廢水，發現螺旋藻對氨氮的吸收效果隨著藻添加量的增加，其氨氮去除速度更快。本試驗第8天時，鈍頂螺旋藻對氨氮也表現出了較好的吸收效果。鹽藻具有廣泛的適鹽性，同時該藻富含胡蘿卜素、甘油和蛋白質等，是一種重要的海洋經濟藻類，在食品、醫藥和養殖業中具有獨特的商業價值（虞海天，2014；李元翔，2019）。本研究發現，鹽藻對海水養殖尾水中氨氮去除率達到95.12%，與胡海燕（2007）的研究結果類似。葉志娟和劉兆普（2015）發現鹽藻在海水養殖廢水中生長良好，且對氨氮、硝態氮以及磷酸鹽均有較高的去除率。牟氏角毛藻是海水養殖池塘常見的有益藻，因其細胞富含不飽和脂肪酸常被選做餌料；同時，有研究發現角毛藻可用于吸收和凈化養殖水體中的氮磷營養鹽（張特，2012）；在較低濃度硝態氮（1.070 mg/L）和磷酸鹽（0.232 mg/L）的海水養殖廢水中培養牟氏角毛藻，其去除率分別為95.89%和91.81%（葉志娟和劉兆普，2015）。本研究中，牟氏角毛藻第16天的磷酸鹽去除率為98.25%，與其結果相似，且去除絕對值更高，說明其在本試驗條件下對磷酸鹽去除效果更好；硝態氮去除率為28.58%，與之相比較低，但去除絕對濃度明顯更高，達到37.93 mg/L。謝麗娟（2019）利用未稀釋的高鹽度養殖尾水硝態氮和氨氮培養牟氏角毛藻12 d，去除率分別為58.2%和52.5%，本研究硝態氮和氨氮去除率為28.58%和69.09%，這可能與本研究培養環境中的高硝酸鹽氮濃度有關；同時其研究中磷酸鹽在第8天消耗殆盡，與本次牟氏角毛藻組對磷酸鹽的最高去除率基本相同。本研究發現牟氏角毛藻對集約化養殖尾水中的磷酸鹽凈化作用顯著高于鹽藻（P<0.05），在葉志娟（2006）的研究中也有類似發現。

利用微藻凈化養殖尾水過程中，存在微藻難以收集的大問題，相較于鹽藻和牟氏角毛藻，鈍頂螺旋藻藻體較大，便于后期收集處理是其主要的優勢。螺旋藻作為水產養殖的常用藻種，其藻細胞中包含多種氨基酸、礦物質，蛋白含量更是高達60%～70%（姚丹等，2012）；相對于鹽藻和牟氏角毛藻，其對高濃度氮磷的對蝦BFT集約化養殖尾水的凈化效果更好，并且藻細胞生物量大回收利用更便捷。當前螺旋藻的開發利用已形成相對完善的產業鏈，不僅可以用來作為理想蛋白來源和保健品，其在水產上還經常用作飼料及原料使用。

4? ?結論

（1）鈍頂螺旋藻、鹽藻和牟氏角毛藻在含有高濃度氮磷的對蝦BFT集約化養殖尾水中均可存活生長，鈍頂螺旋藻對尾水中的硝態氮、總無機氮去除率顯著高于鹽藻和牟氏角毛藻（P<0.05）。

（2）鈍頂螺旋藻的氨氮最高去除率可達95%以上，磷酸鹽的最高去除率為98.55%；鹽藻16 d的氨氮去除率最優；牟氏角毛藻16 d的磷酸鹽去除率3組中最高，為98.25%。

（3）鈍頂螺旋藻、鹽藻和牟氏角毛藻均可用于海水對蝦集約化養殖尾水的凈化，綜合來看以鈍頂螺旋藻為最優選擇。

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（責任編輯? ?萬月華）

Comparison of Three Microalgae for Removing Nitrogen and Phosphorus

from the Tail Waters of Intensive Seawater Shrimp Aquaculture

PAN Zhi‐heng1，2， LU Min1，2， CAO Yu‐cheng2， XU Yu2， XU Wu‐jie2， HU Xiao‐juan2，

SU Hao‐chang2， WEN Guo‐liang1，2

（1. Zhejiang Ocean University， National Engineering Research Center for Marine Aquaculture，

Zhoushan? ?316022， P.R. China;

2. South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences，

Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization，

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment，

Guangzhou? ?510300， P.R. China）

Abstract：Using tail waters from an intensive biofloc shrimp aquaculture system with high concentrations of inorganic nitrogen and phosphorus， we compared the growth of three microalgae species （Spirulina platensis， Chaetoceros muelleri， Dunaliella sp.） in the tail water and their removal of inorganic nitrogen and phosphorus. Our aim was to provide data to support screening for and obtaining microalgae that are effective for tail water purification. Tail water collected from the shrimp aquaculture system were adjusted for testing to an N：P ratio of 13：1 after sterilization. Treatments with each algae species and a control group were run in triplicate， with initial microalgae concentrations of 3.32×106 cells/mL in the S. platensis group， 2.50×105 cells/mL in the Dunaliella sp. group and 4.00×104 cells/mL in the C. muelleri group. The test lasted for 16 days， and microalgae samples were collected before and after the test to determine changes in the cell density of each microalgae species by microscope counting. The removal of total inorganic nitrogen， ammonia nitrogen， nitrate nitrogen， nitrite nitrogen， and phosphate in the tail water was analyzed by comparing the concentrations of each nutrient on day 0， 2， 4， 6， 8 and 16 of the test， using national standard methods. The cell density of S. platensis did not change significantly during the experiment， remaining at ～3.32×106 cells/mL （P>0.05）. The cell densities of Dunaliella sp. and C. muelleri increased significantly， from initial concentrations of 2.50×105 cells/mL and 4.00×104 cells/mL to final densities 1.06×107 cells/mL and 1.66×106 cells/mL （P<0.05）. The removal rates of nitrate nitrogen and total inorganic nitrogen in S. platensis treatment were respectively， 79.60% and 46.06%， significantly higher than those in the other groups （P<0.05）， and the highest removal rate （98.55%） of phosphate was on day 8. The removal rate of phosphate in C. muelleri treatment was 98.25% on day 16， significantly higher than that in other groups （P<0.05）. In conclusion， the three microalgae species grew well in the tail water from intensive shrimp aquaculture， removal of inorganic nitrogen and phosphorus was effective， and S. platensis was the best， overall， for the biological purification of tail water.

Key words：tail water of the intensive shrimp aquaculture system; Spirulina platensis; Chaetoceros muelleri; Dunaliella sp.; nitrogen and phosphorus nutrients

收稿日期：2022-01-13? ? ? 修回日期：2023-04-25

基金項目：國家重點研發計劃（2020YFD0900401）；中國水產科學研究院南海水產研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（2021SD08）；中國水產科學研究院基本科研業務費（2023TD57）；財政部和農業農村部—國家現代農業產業技術體系（CARS-48）；廣東省現代農業產業技術體系創新團隊建專項資金（2023KJ149）。

作者簡介：潘志恒，1996年生，男，碩士研究生，研究方向為養殖尾水菌藻凈化。E-mail：193256166@qq.com

通信作者：文國樑，1978年生，男，研究員，主要從事對蝦健康養殖研究。E-mail：guowen66@163.com