褪黑激素對小鼠缺血/再灌注損傷腦組織ATF-6影響

［摘要］ 目的 探討褪黑激素（Melatonin）能否通過抑制內質網應激相關蛋白激活轉錄因子-6（ATF-6）對小鼠腦缺血/再灌注（I/R）損傷發揮保護作用。

方法 將36只C57BL/6J小鼠隨機分為假手術組（Sham組）、I/R組、I/R+生理鹽水（NS）組及I/R+Melatonin組，各9只。使用線栓法建立大腦中動脈I/R損傷模型，腹腔注射生理鹽水作為I/R+NS組，腹腔注射Melatonin作為I/R+Melatonin組。采用2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）染色觀察各組小鼠腦組織梗死面積，HE染色觀察各組小鼠腦組織形態，Western blot法檢測腦組織中ATF-6及其下游靶點C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達。

結果 與Sham組相比，I/R組出現明顯梗死區域，I/R+Melatonin組梗死面積明顯減小（F=30.60，Plt;0.01）；與I/R組相比，I/R+Melatonin組神經細胞排列紊亂和凋亡顯著改善，I/R+Melatonin組ATF-6及CHOP表達顯著降低（F=56.11、225.50，Plt;0.01）。

結論 I/R損傷后，Melatonin通過抑制ATF-6及其下游信號通路CHOP蛋白的表達發揮神經保護作用。

［關鍵詞］ 腦缺血；再灌注損傷；內質網應激；神經保護

［中圖分類號］ R338.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0011-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.007

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail//37.1517.R.20230221.1007.004.html;2023-02-22 09：56：28

EFFECT OF MELATONIN ON ATF-6 IN MOUSE BRAIN TISSUE WITH ISCHEMIA/REPERFUSION INJURY

KUANG Xue-

yan， HOU Lin， HOU Qingming

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ "Objective "To investigate whether Melatonin can protect against ischemia/reperfusion （I/R） brain injury in mice by inhibiting the endoplasmic reticulum stress sensor activating transcription factor 6 （ATF-6）.

Methods "C57BL/6J mice were randomly divided into sham-operated （Sham） group， I/R group， I/R+normal saline （NS） group， and I/R+Melatonin group. The middle cerebral artery ischemia/reperfusion injury model was established using the suture method. Saline was injected intraperitoneally for the I/R+NS group and Melatonin was injected intraperitoneally for the I/R+Melatonin group. The infarct area was observed by 2， 3， 5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining， the morphology of brain tissue was observed by hematoxylin-eosin （HE） staining， and the expression of ATF-6 and its downstream target C/EBP homologous protein （CHOP） in brain tissue was measured by Western blot.

Results "Compared with the Sham group， infarct area was observed in the I/R group， but significantly reduced in the I/R+Melatonin group （F=30.60，Plt;0.01）. The I/R+Melatonin group showed significant improvements in neuronal disarray and apoptosis and significant reductions in the expression of ATF-6 and CHOP， as compared with the I/R group （F=56.11，225.50;Plt;0.01）.

Conclusion "For cerebral I/R injury， Melatonin exerts neuroprotective effects by inhibiting the expression of ATF-6 and CHOP in its downstream signaling pathway.

［KEY WORDS］ "brain ischemia; reperfusion injury; endoplasmic reticulum stress; neuroprotection

腦卒中是世界范圍內第二大死亡病因，其中缺血性腦卒中占腦卒中總數的80%左右［1］。缺血性腦卒中發生時腦組織供血供氧突然中斷，形成以神經元壞死為主的核心區及缺血半暗帶［2-3］。半暗帶內神經元代謝障礙，同時伴隨凋亡發生［4］。細胞代謝障礙亦能引發包括內質網應激在內的一系列分子改變［4-5］。內質網應激相關蛋白激活轉錄因子-6（ATF-6）為內質網跨膜蛋白［6-7］。有研究表明，使用藥物作用于ATF-6能夠顯著減輕細胞凋亡，降低凋亡相關細胞因子如Caspase3、Caspase6等表達［9-10］。已有研究表明，針灸能通過降低ATF-6相關的內質網應激減輕缺血/再灌注（I/R）腦損傷［11］。褪黑激素（Melatonin）屬于胺類激素，在體內由松果體分泌，能夠調節睡眠-覺醒周期。有研究顯示，Melatonin是ATF-6的有效抑制劑［8］，且具有抗炎、抗氧化應激及抗凋亡等活性，在多種疾病模型中發揮保護作用。

但Melatonin是否能通過類似機制發揮神經保護作用尚未闡明。本研究旨在討論ATF-6在小鼠I/R模型中的意義，并觀察Melatonin能否通過

抑制ATF-6及其下游信號通路蛋白的表達發揮神經保護作用。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

雄性健康C57BL/6J小鼠共40只，體質量為（23±2）g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。制備小鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型的線栓購自廣州佳靈生物技術有限公司，2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）購自武漢科瑞生物技術有限公司；ATF-6一抗購自Affinity抗體公司；C/EBP同源蛋白（CHOP）一抗購自Affinity抗體公司；β-actin購自武漢三鷹生物技術公司；二抗購于北京索萊寶科技有限公司；Melatonin購自美國MCE公司；40 g/L多聚甲醛（PFA）購于北京索萊寶科技有限公司；小動物手術麻醉系統及瑞沃德動物手術顯微鏡（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；BIORAD電泳及轉膜系統（美國BIORAD公司）；Protein顯影儀（美國peoteinsimple公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 I/R模型制備及實驗分組 使用線栓法制備I/R模型。I/R模型的制作方法參照相關文獻方法［12］。小鼠仰臥位固定于手術臺，低濃度異氟烷持續麻醉。術中使用恒溫毯維持體溫。小鼠頸部正中切口，暴露右側頸外動脈，插入L1800線栓至右側頸內動脈使右側大腦中動脈閉塞，90 min后移除線栓再灌注6 h。采用Zea Longa評分驗證模型制備是否成功，1～3分為造模成功，造模不成功及死亡小鼠共4只剔除。小鼠隨機分為假手術組（Sham組，A組）、模型組（I/R組，B組）、NS對照組（I/R+NS組，C組）和Melatonin給藥組（I/R+Melatonin組，D組），各9只小鼠。假手術組僅做切口處理，I/R組造模成功后不做處理，I/R+NS組腹腔注射NS，I/R+Melatonin組小鼠則腹腔注射Melatonin（100 mg/kg）。所有小鼠均于再灌注24 h處死，取腦組織。

1.2.2 TTC染色觀察小鼠腦組織梗死面積 腦組織取材后迅速置于－80 ℃冰箱冷凍10 min后取出，冠狀面均勻切片后浸泡于20 g/L濃度TTC溶液內，37 ℃染色30 min，取出，用40 g/L PFA固定，掃描，Image J軟件分析腦缺血面積百分比。缺血區面積百分比=（各切片白色缺血區面積之和/各切片腦片面積之和）×100%。

1.2.3 HE染色觀察小鼠腦組織形態 腦組織取出后迅速放入40 g/L PFA固定24 h，石蠟包埋、切片（3 μm厚度），二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后蒸餾水清洗；蘇木精（2 g/L）染色5 min，流水沖洗，放入體積分數0.01鹽酸乙醇中數秒后流水沖洗；后將樣品浸入10 g/L的伊紅溶液染色，流水沖洗；梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機選取缺血半暗帶進行觀察。

1.2.4 Western blot法檢測腦組織中ATF-6及CHOP蛋白的表達 取腦缺血半暗帶區域皮質組織加入蛋白提取裂解液中，超聲破碎儀震蕩破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心15～20 min，取上清液置另一EP管中。BCA法測定蛋白濃度，使用上樣緩沖液調整濃度后100 ℃變性10 min，分裝保存。每個上樣孔取15 μg的蛋白樣品上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉印至硝酸纖維素（PVDF）膜上，室溫封閉2 h。分別加入ATF-6、CHOP及β-actin一抗稀釋液（1∶1 000）4 ℃冰箱過夜，再加入相應二抗室溫孵育1 h，ECL顯影。以β-actin為內參，使用Image J軟件對灰度值進行定量分析。以ATF-6/β-actin和CHOP/β-actin表示腦組織中ATF-6及CHOP蛋白的表達。

1.3 統計學處理

應用Graph Pad Prism 9.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 各組腦組織梗死面積比較

TTC結果顯示，各組腦組織梗死面積大小差異有統計學意義（F=30.60，Plt;0.01），其中I/R組梗死區域面積百分比（29.33±0.55）大于Sham組（0），I/R+Melatonin組（22.07±1.10）小于I/R組，差異均有顯著性（Plt;0.05）；I/R+NS組梗死面積百分比（29.27±0.44）與I/R組比較差異無統計學意義（Pgt;0.05）。見圖1。

2.2 各組腦組織形態學比較

HE染色觀察顯示，Sham組缺血半暗帶內神經元排列整齊且形態規則；I/R組出現神經細胞丟失、核固縮，形態呈現多形性且與周圍組織間出現空殼區。與I/R組相比，I/R+NS組無顯著改變；I/R+Melatonin組上述病理改變顯著減輕，缺血半暗帶存活神經元多于I/R組（圖2）。

2.3 各組ATF-6及CHOP蛋白表達比較

Western blot檢測顯示，各組內質網應激相關通路蛋白ATF-6及其下游信號蛋白CHOP表達差異有統計學意義（F=56.11、225.50，Plt;0.01），其中I/R組ATF-6和CHOP表達明顯高于Sham組，I/R+Melatonin組低于I/R組，差異均有統計學意義（Plt;0.05）；I/R+NS組ATF-6和CHOP表達與I/R組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見圖3、表1。

3 討" 論

腦卒中是世界范圍內死亡率高、致殘率高的疾病［13］。缺血性腦卒中占腦卒中絕大多數，其發病后可能給家庭及社會帶來沉重負擔［14］。缺血性卒中發生后腦組織出現不同程度I/R損傷，同時缺血區域由于突發糖氧供應中斷致使代謝障礙，未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網中積累，引發內質網應激［15］，導致細胞穩態失衡，從而進一步導致組織和器官損傷［16］。在I/R后尋找可能的內質網應激相關靶點并針對靶點尋找能夠減輕腦損傷的藥物具有重要意義［17］。

越來越多的證據表明，內質網應激在神經元存活過程中發揮重要作用［18-20］。內質網應激信號通路包括ATF-6、IRE1α和PERK通路。脊髓損傷后大鼠神經元出現內質網應激且ATF-6的表達上調，miR-211-5p可直接靶向ATF-6并緩解神經元凋亡和炎癥［21］。阿爾茨海默病病人神經元樣細胞內質網應激相關蛋白ATF-6表達升高，丁香酸可通過下調ATF-6表達發揮細胞保護作用［22］。提示ATF-6及其下游信號通路很大程度決定神經元命運。激活后的ATF-6可易位至細胞核并誘導下游信號蛋白CHOP的表達［23］。CHOP是內質網應激反應共同下游信號分子，正常生理狀態下表達量低，內質網應激狀態下大量表達并促進細胞凋亡［24-25］。腦卒中后神經元可以通過CHOP發出信號并最終導致細胞凋亡發生［26］。本研究結果顯示，ATF-6及其下游CHOP在I/R后表達增加，說明缺血性腦損傷模型中存在內質網應激，與相關研究結果一致［16，27］。

有研究表明，針灸穴位百匯和曲鬢對I/R腦損傷有保護作用，該作用通過抑制ATF-6引起的內質網應激及自噬產生［11］。除此之外，西洛他唑也可以通過抑制內質網應激緩解I/R誘導的內皮細胞損傷［28］。因此，抑制內質網應激可能是腦I/R損傷的有效治療策略。Melatonin屬于胺類激素，在體內由松果體分泌，能夠調節睡眠-覺醒周期［29］。有研究顯示，Melatonin是ATF-6的有效抑制劑［8］，且具有抗炎、抗氧化應激及抗凋亡等活性［30］，在多種疾病模型中發揮保護作用［31］。推測Melatonin可能通過抑制ATF-6對I/R腦損傷產生保護作用。本文研究顯示，Melatonin能夠下調I/R后腦組織缺血半暗帶ATF-6的表達，進而調節下游CHOP的表達，說明給予治療后缺血半暗帶內內質網應激減輕；此外，給予Melatonin后缺血半暗帶梗死面積減小，缺血低氧引起的神經元排列紊亂及細胞形態不規則等減輕。提示Melatonin能夠減少缺血再灌注損傷導致的神經元凋亡，發揮神經保護作用。

綜上所述，Melatonin通過降低ATF-6及其下游信號通路CHOP蛋白的表達抑制內質網應激，從而發揮神經保護作用。但是本研究未能進一步檢測CHOP下游蛋白如Bcl-2等的變化趨勢，也未闡明ATF-6內質網應激信號通路是否與其他通路存在關聯，后續將進一步在動物模型中進行探討。

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（本文編輯 黃建鄉）