祛風扶正散調控TLR4/NF-κB信號通路治療周圍性面癱的作用機制

［摘要］ 目的 探討祛風扶正散調控Toll樣受體4（TLR4）/核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路治療周圍性面癱的作用機制。

方法 建立RAW264.7細胞炎癥模型，用不同濃度祛風扶正散受試物處理炎癥模型細胞，采用Griess reagent法檢測細胞一氧化氮（NO）的分泌量，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測細胞上清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、前列腺素2（PEG2）的水平，活性氧熒光探針（DCFH-DA）法檢測細胞內活性氧（ROS）的水平，實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細胞TNF-α、IL-1β mRNA的表達，蛋白印跡法（Western blot）檢測細胞p65、磷酸化p65（p-p65）、IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）蛋白表達。

結果 祛風扶正散可顯著降低炎癥模型細胞NO、ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6及PEG2表達水平（F=338.731～5 790.712，Plt;0.01），下調TNF-α、IL-1β mRNA表達（F=134.430、168.217，Plt;0.01），抑制p-p65和p-IκBα蛋白表達、IκBα降解及p65核易位（F=17.793～97.613，Plt;0.01）。

結論 祛風扶正散治療周圍性面癱的作用機制可能與抑制本病相關TLR4/NF-κB信號通路的活化及其下游促炎性細胞因子、炎癥遞質的釋放有關。

［關鍵詞］ 面神經麻痹；中藥；祛風扶正散；Toll樣受體4；NF-κB

［中圖分類號］ R745.12;R285

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0073-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.030

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20230314.2037.001.html;2023-03-16 11：42：26

MECHANISM OF ACTION OF QUFENG FUZHENG POWDER IN TREATMENT OF PERIPHERAL FACIAL PARALYSIS BY RE-

GULATING THE TOLL-LIKE RECEPTOR 4/NUCLEAR FACTOR-KAPPA B SIGNALING PATHWAY

ZHOU Lihua， ZHOU Changkai， SHANG Xiuling， JING Fanbo

（College of Pharmacy， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ "Objective "To investigate the mechanism of action of Qufeng Fuzheng powder in the treatment of peripheral facial paralysis by regulating the Toll-like receptor 4 （TLR4）/nuclear factor-kappa B （NF-κB） signaling pathway.

Methods

RAW264.7 cells were used to establish an inflammation model， and then the cells were treated with different concentrations of Qufeng Fuzheng powder. The Griess reagent method was used to measure the secretion of nitric oxide （NO）; ELISA was used to measure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and prostaglandin-2 （PEG2） in cell supernatant; the DCFH-DA fluorescent probe was used to measure the level of reactive oxygen species （ROS） in cells; quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of TNF-α and IL-1β， and Western blot was used to mea-

sure the protein expression levels of p65， phosphorylated p65 （p-p65）， nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor， alpha （IκBα）， and phosphorylated IκBα （p-IκBα）.

Results "Qufeng Fuzheng powder significantly reduced the le-

vels of NO， ROS， TNF-α， IL-1β， IL-6， and PEG2 in cells （F=338.731-5 790.712，Plt;0.01） and downregulated the mRNA expression levels of TNF-α and IL-1β （F=134.430，168.217;Plt;0.01）. Moreover， it also inhibited the protein expression of p-p65 and p-IκBα， the degradation of IκBα， and the nuclear translocation of p65 （F=17.793-97.613，Plt;0.01）.

Conclusion "Qufeng Fuzheng powder exerts a therapeutic effect on peripheral facial paralysis possibly by inhibiting activation of the TLR4/NF-κB signaling pathway and the release of its downstream proinflammatory cytokines and inflammatory mediators.

［KEY WORDS］ "facial paralysis; traditional Chinese drugs; Qufeng Fuzhegn powder; Toll-like receptor 4; NF-kappa B

周圍性面癱為現代醫學病名，是由莖乳孔及以下部位面神經發生急性非化膿性炎癥所致［1-3］。據統計，周圍性面癱在我國的發病率為34/10萬，遠高于歐美國家的5/10萬，男女發病率相同［4］。祖國醫學認為，本病是因人體正氣不足，衛外功能不固，脈絡空虛，外邪乘虛而入，傷及頭面陽明脈絡，使顏面一側營衛不和、氣血痹阻、經脈失養所致［5-6］。祛風扶正散為源自唐代經方，憑借對周圍性面癱的確切

療效被后人沿用［7-9］。然而，本方治療該病作用機制仍不明確，在一定程度上制約了經方現代制劑的開發創制。既往研究表明，Toll樣受體4（TLR4）/核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路或為本病的有效干預靶點［10-11］。本研究通過建立RAW264.7細胞炎癥模型，初步探討本方對周圍性面癱相關TLR4/NF-κB信號通路的調控機制，以期為經方制劑開發與臨床精準治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RAW264.7小鼠巨噬細胞購自武漢普諾賽生命科技公司。脂多糖（LPS）購自Sigma公司；CCK8購自MCE公司；DMEM培養液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、乙二胺四乙酸（EDTA）均購自Gibco公司；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自伊萊瑞特公司；一氧化氮（NO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒均購自VAZYME公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司；二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；兔多抗p65購自Abcam公司；兔單抗磷酸化p65（p-p65）、兔多抗磷酸化IκBα（p-IκBα）均購自Affinity公司；兔多抗IκBα購自武漢三鷹生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 祛風扶正散受試物的制備 稱取制川烏中粉20 g，置于圓底燒瓶中，加入體積分數0.75的乙醇500 mL，回流提取1.5 h，濾過后得提取液。殘渣按照第一次的處理方法重復操作，合并兩次提取液，50 ℃減壓濃縮至0.5 kg/L，加入10 g皂礬混勻后，得受試物樣品，終質量濃度為0.75 kg/L（以相當于生藥材質量/液體體積計）。

1.2.2 RAW264.7細胞的培養及傳代 將細胞從液氮中取出，用含體積分數0.10胎牛血清的完全培養液，在37 ℃、體積分數0.05 CO2恒溫培養箱中進行常規培養。當細胞密度達到80%時，按1∶4的比例傳代，在37 ℃、體積分數0.05 CO2、飽和濕度條件下擴大培養。

1.2.3 CCK8方法檢測不同濃度的受試物對細胞增殖的影響 取處于對數生長期、生長狀態良好的RAW264.7細胞，用培養液將細胞密度調整到108/L，接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，于37 ℃、體積分數0.05 CO2培養箱中培養過夜。加入不同濃度（0、3.75、7.50、15.00、22.50、30.00、37.50、60.00、75.00 g/L）的受試物培養1 h后，更換新鮮DMEM培養液，并加入CCK8溶液每孔10 μL，繼續培養2 h后，用酶標儀測定各孔在450 nm波長下的吸光度。

1.2.4 Griess reagent法測定NO的含量 根據CCK8實驗結果，設置空白組、LPS（1 mg/L）組、藥物低劑量（3.75 g/L）組和藥物高劑量（15.00 g/L）組。空白組不做任何處理，LPS組只加入LPS，各藥物組加入不同濃度受試物1 h后再加入LPS共同培養細胞24 h。然后，加入50 μL Griess試劑與50 μL培養液在96孔板中混合反應5 min。收集上清液并按照NO試劑盒操作說明測定細胞NO的分泌量。

1.2.5 ELISA法檢測細胞上清液中炎癥因子的含量 設置空白對照組（A組）、LPS（1 mg/L）組（B組）和藥物低、中、高劑量（3.75、7.50、15.00 g/L）組（C、D、E組）。將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于96孔板，置37 ℃、體積分數0.05 CO2培養箱中培養過夜，空白對照組不做任何處理，LPS組只加入LPS，各藥物組加入不同濃度受試物1 h后再加入LPS共同培養24 h。離心收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒操作說明檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、前列腺素2（PEG2）含量。

1.2.6 活性氧熒光探針（DCFH-DA）法檢測細胞內ROS含量 實驗分組與給藥同1.2.5，培養24 h后去除細胞培養液，加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，置37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，充分洗滌后，使用奧林巴斯BX53熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）檢測細胞內ROS含量，檢測所用激發和發射波長分別為488 nm和525 nm。

1.2.7 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測TNF-α、IL-1β mRNA的表達 實驗分組與給藥同1.2.5，處理24 h后采用Trizol法提取細胞總RNA。采用Primer5軟件進行引物設計，引物序列見表1。按照反轉錄試劑盒操作說明進行逆轉錄。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃退火15 s，40個循環。每個樣品設3個復孔，TNF-α、IL-1β mRNA表達水平以相對表達量表示。

1.2.8 蛋白印跡法（Western blot）檢測TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白的表達 參照1.2.5中的方法培養和處理各組RAW264.7細胞，吸掉各孔細胞培養液，以PBS液清洗3次，采用RIPA裂解法提取各孔細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品煮沸變性后，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h后加入一抗，4 ℃孵育過夜，以TBST搖洗5次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育2 h，以TBST搖洗5次，每次5 min。用ECL顯色，凝膠成像系統顯像，采用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，應用Graphpad prism 6.0軟件繪圖。所得實驗數據以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA檢驗，以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結" 果

2.1 不同濃度的受試物對RAW264.7細胞增殖的影響

CCK8法檢測結果顯示，受試物濃度在3.75～15.00 g/L時，對RAW264.7細胞活力沒有明顯影響，而其他濃度組與空白組比較差異有統計學意義（F=14.052，Plt;0.01），故選擇3.75、7.50、15.00 g/L作為受試物的低、中、高劑量濃度進行后續實驗。見圖1。

2.2 受試物對炎癥模型細胞分泌NO的影響

Griess reagent檢測結果顯示，與空白組相比較，LPS組RAW264.7細胞NO的分泌量顯著增加（F=338.731，Plt;0.01）；與LPS組細胞相比較，藥物低劑量組RAW264.7細胞NO的分泌量顯著降低（Plt;0.05），藥物高劑量組細胞NO的分泌量極顯著降低（Plt;0.01）。見圖2。

2.3 受試物對炎癥模型細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2分泌的影響

ELISA檢測結果顯示，與空白對照組相比較，LPS組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2含量顯著升高（F=343.345～5 790.712，Plt;0.01）；與LPS組相比，藥物低、中、高劑量組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的分泌呈劑量依賴性受到抑制（Plt;0.01）。見表2。

2.4 受試物對炎癥模型細胞ROS分泌的影響

DCFH-DA檢測結果顯示，與空白對照組相比，LPS組細胞ROS分泌量顯著增加；與LPS組相比，經受試物預處理后，藥物低、中、高劑量組ROS的分泌量均顯著降低。見圖3。

2.5 受試物對炎癥模型細胞TNF-α、IL-1β表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，與空白對照組相比較，LPS組細胞TNF-α、IL-1β mRNA的表達水平顯著升高（F=134.430、168.217，Plt;0.01）；與LPS組相比較，藥物低、中、高劑量組細胞的TNF-α、IL-1β mRNA表達水平顯著降低，而且受試物對TNF-α、IL-1β mRNA表達的抑制作用呈劑量依賴性（Plt;0.05）。見表3。

2.6 受試物對炎癥模型細胞TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

Western blot檢測結果表明，與空白對照組相比，LPS組細胞IκBα蛋白表達水平顯著降低，核內p65、p-p65和p-IκBα蛋白表達水平顯著升高（F=17.793～97.613，Plt;0.01）；與LPS組相比，藥物低劑量組細胞p-IκBα蛋白表達水平顯著降低，藥物中、高劑量組細胞IκBα蛋白表達水平顯著升高，核內p65、p-p65、p-IκBα蛋白表達水平顯著降低（Plt;0.05）。見圖4和表4。

3 討" 論

周圍性面癱是臨床常見病、多發病，可發生于任何季節，常以春秋季節多發，臨床表現為一側面部表情肌癱瘓、額紋變淺、眼裂增大、眼瞼不能閉合、鼻唇溝變淺等癥狀［12-13］。目前該病的發病原因尚不明確，西醫臨床針對周圍性面癱尚無特異性治療手段，多以皮質類固醇激素抗炎消腫和抗病毒治療為主。中醫認為，周圍性面癱屬于“口僻”范疇，多因機體正氣不足、脈絡虧虛，外感風寒、風熱、火毒之邪或內生痰濕乘虛侵襲、痹阻經脈，肌肉經筋失養、縱緩不收所致［5-6］。祛風扶正散之經方治療周圍性面癱臨床療效確切，方中君藥川烏為毛茛科植物烏頭的干燥母根，具有祛風除濕、溫經止痛的功效，被廣泛應用于炎癥疾病的治療［14-15］。川烏有大毒，未經炮制服用可出現中毒，重者會導致死亡［16-17］?，F代臨床多使用制川烏，本課題組前期采用正交試驗優化了制川烏功效成分的提取工藝［18］。本研究應用此提取工藝獲得受試物樣品。

跨膜Toll樣受體（TLRs）作為信號轉導蛋白，是一類模式識別受體，TLR4為其家族成員之一，可特異性識別LPS［19-21］。TLR4/NF-κB信號通路是炎癥反應中主要的信號通路［22-23］。LPS刺激活化的TLR4經MyD88依賴性信號轉導途徑，導致NF-κB激活并入核啟動炎癥因子基因表達。NF-κB是一種核轉錄激活因子，主要由p65和p50兩個亞基組成［24-25］。生理情況下，NF-κB磷酸化位點被IκB抑制蛋白結合封閉，處于無活性狀態；在各種炎性損傷中，IκB被磷酸化降解，釋放和活化NF-κB，使p50的核定位信號暴露，攜帶p65迅速轉移至核內，p65可以識別特定的DNA序列，誘導多種細胞因子過量表達［26］。NF-κB通過激活、擴大炎癥反應以及調控細胞因子的轉錄和表達，影響周圍神經的再生與修復，臨床研究發現其在細胞凋亡與增殖、免疫應答、炎癥反應調節等過程中均發揮重要作用［27-28］，近年來已發展為炎癥疾病的重要治療靶點。

周圍性面癱病人體內TLR4/NF-κB信號通路發生活化，TLR4蛋白與NF-κB p65磷酸化水平升高，下游炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達水平上升，提示TLR4/NF-κB信號通路可能在周圍性面癱的發生發展中具有重要作用［10-11］。既往研究表明，周圍神經損傷后，損傷應激反應會迅速激活雪旺細胞內的NF-κB信號通路，NF-κB被激活后進一步誘導內源性巨噬細胞產生TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子［29-30］。這些炎癥因子的上調進一步激活NF-κB信號通路，引起炎癥級聯放大反應，誘導單核細胞表達趨化因子，使各種炎性細胞聚集到病變部位，導致神經纖維脫髓鞘、軸索變性、神經細胞損傷，最終促進周圍神經病變的發生發展；另一方面，這些炎癥因子可以刺激巨噬細胞、內皮細胞高表達一氧化氮合酶（iNOS）、環氧合酶2（COX-2），導致NO和PGE2大量合成與釋放，引起周圍神經功能障礙［31］。同時，周圍神經損傷后，組織內ROS生成增加，高濃度的ROS可以通過影響血管平滑肌和炎癥細胞的增殖及遷移、內皮細胞的凋亡、轉錄因子的活化、炎癥細胞因子和黏附分子的過度表達，介導內皮細胞損傷，從而促進周圍神經病變的發展［32］。

既往尚無祛風扶正散治療周圍性面癱作用機制相關報道，這在一定程度上影響了相關制劑的開發創制。本研究通過建立體外細胞模型首次對其作用機制進行探討，結果提示，LPS可誘導RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、PGE2和ROS等炎性因子和炎癥遞質分泌增加，TNF-α、IL-1β mRNA表達水平升高，不同濃度的祛風扶正散受試物預處理可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子和炎癥遞質的分泌，降低TNF-α、IL-1β mRNA的表達水平，且以高劑量組的效果最佳。Western blot檢測結果表明，祛風扶正散受試物可有效抑制LPS誘導的RAW264.7細胞TLR4/NF-κB信號通路中p65和IκBα的磷酸化，減少IκBα的降解，降低核內p65、p-p65的表達水平。上述結果表明，祛風扶正散可調控周圍性面癱相關的TLR4/NF-κB信號通路，其治療本病的機制可能與該通路有關。

綜上所述，TLR4/NF-κB信號通路是周圍性面癱發生發展中重要的信號通路，祛風扶正散是一種良好的TLR4/NF-κB調節劑，可抑制TLR4/NF-κB信號轉導通路的活化，降低LPS誘導的RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β mRNA的表達以及TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、PGE2、ROS的產生水平，提示其治療周圍性面癱的機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化有關。本研究僅在體外細胞水平上對TLR4/NF-κB信號通路的表達變化進行了探討，初步研究結論為將來在動物水平上開展相關機制研究提供了一定的數據支持，但關于祛風扶正散治療周圍性面癱的分子作用機制仍需更深入的研究。

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（本文編輯 馬偉平）