絨毛間充質干細胞對滋養細胞增殖和自噬的影響

［摘要］ 目的 探討人胎盤絨毛間充質干細胞（CV-MSC）對滋養細胞增殖和自噬的影響。

方法 在低氧條件下應用CV-MSC條件培養液處理HTR-8和JEG-3滋養細胞株。應用CCK-8試劑盒檢測滋養細胞的增殖能力，采用免疫熒光法檢測自噬蛋白LC-3B在滋養細胞內的表達，采用蛋白印跡法（Western blot）檢測滋養細胞內自噬相關蛋白LC-3B、BECN1和P62的表達水平，采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測滋養細胞內Cludin-11（CLDN11）以及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路相關基因mTOR、S6K1的mRNA表達水平，采用Western blot檢測滋養細胞內CLDN11、mTOR、S6K1的蛋白表達水平及磷酸化程度。

結果 與低氧組相比，低氧+CV-MSC條件培養液處理組HTR-8和JEG-3滋養細胞增殖的吸光度值顯著增高（F=51.9、26.9，Plt;0.05），CLDN11、mTOR、S6K1的mRNA及蛋白表達水平顯著降低（F=3.9～9.1，Plt;0.01），LC-3B、BECN1蛋白表達水平增加，P62蛋白表達水平降低。

結論 低氧條件下CV-MSC可以通過抑制CLDN11表達、失活mTOR通路、增強細胞自噬促進滋養細胞的增殖。

［關鍵詞］ 絨毛膜絨毛；間質干細胞；殼牢素類；mTOR調節相關蛋白；細胞增殖；自噬

［中圖分類號］ R714.24;R329.25

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0087-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.039

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230308.1033.001.html;2023-03-09 16：50：39

EFFECT OF CHORIONIC VILLOUS MESENCHYMAL STEM CELLS ON TROPHOBLAST PROLIFERATION AND AUTOPHAGY

HOU Lei， LIU Shiguo， ZHANG Yan， GAO Guoqiang， CHU Yijing， YE Yuanhua

（Department of Obstetrics， Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ "Objective "To investigate the effect of human placental chorionic villous mesenchymal stem cells （CV-MSC） on placental trophoblast proliferation and autophagy.

Methods "Trophoblast cell lines HTR-8 and JEG-3 were treated with CV-MSC conditioned medium under hypoxic conditions. CCK-8 kit was used to measure the proliferative capacity of trophoblasts; immunofluorescence assay was used to measure the expression of the autophagy-related protein LC-3B in trophoblasts; Western blot was used to measure the expression levels of the autophagy-related proteins LC-3B， BECN1， and P62 in trophoblasts; reverse transcription-polymerase chain reaction was used to measure the mRNA expression levels of Cludin-11 （CLDN11） and the mammalian target of rapamycin （mTOR） pathway-related genes mTOR and S6K1 in trophoblasts， and Western blot was used to measure the protein expression levels and phosphorylation degrees of CLDN11， mTOR， and S6K1 in trophoblasts.

Results "Compared with the hypoxia group， the hypoxia+CV-MSC conditioned medium treatment group had a significant increase in the absorbance values of JEG-3 and HTR-8 trophoblasts （F=51.9，26.9;Plt;0.05）， significant reductions in the mRNA and protein expression levels of CLDN11， mTOR， and S6K1 （F=3.9-9.1，Plt;0.01）， significant increases in the protein expression of LC-3B and BECN1， and a significant reduction in the protein expression of P62.

Conclusion "CV-MSC under hypoxic conditions can promote the prolife-

ration of trophoblasts by inhibiting CLDN11 expression， inactivating the mTOR pathway， and promoting the autophagy of trophoblasts.

［KEY WORDS］ "chorionic villi; mesenchymal stem cells; claudins; regulatory-associated protein of mTOR; cell proliferation; autophagy

子癇前期是常見的妊娠期疾病，嚴重影響母兒健康，常伴隨胎盤發育異常和胎盤滋養細胞的功能異常［1］。在正常妊娠過程中，滋養細胞進入子宮蛻膜并在氧含量相對較低的子宮蛻膜內生長侵襲，為胎兒提供生長所需的氧氣及營養物質，所以滋養細胞的功能對妊娠過程至關重要［2］。在子癇前期病理過程中，過度氧化應激的母胎界面微環境會導致滋養細胞的異常分化和抗血管生成蛋白分泌增加，導致滋養細胞的功能異常［3］。間充質干細胞（MSC）功能廣泛，目前在抗炎、調節免疫、血管新生、誘導自噬、歸巢和抗凋亡等方面皆表現出積極的作用。研究表明，胎盤MSC可以在內膜血管生成中發揮重要作用［4］。所以通過胎盤絨毛間充質干細胞（CV-MSC）改善滋養層細胞增殖和自噬的能力進而治療妊娠相關疾病成為研究熱點。本研究旨在探討人胎盤CV-MSC對滋養細胞增殖和自噬的作用及其可能的機制，以期為子癇前期的干細胞治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

取足月順產正常新生兒胎盤（孕婦及家屬均簽署知情同意書），剪碎后用PBS沖洗，用2.5 g/L胰蛋白酶和1 g/L的Ⅰ型膠原酶37 ℃振蕩消化1 h，再用100 μm濾網過濾消化液并低速離心。將離心得到的細胞接種于培養瓶中，加干細胞培養液，置于溫度37 ℃、含體積分數0.05" CO2的飽和濕度細胞培養箱中培養，得到CV-MSC［5］。取3～6代的細胞接種于培養液中，常規制備CV-MSV條件培養液（簡稱條培）。

JEG-3和HTR-8細胞系均購于中國ATCC中心，用含體積分數0.10胎牛血清的DMEM/F12培養液，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2的飽和濕度細胞培養箱中培養。模擬低氧條件時，應用低氧細胞培養箱（美國BioSpherix），調整培養箱的氧氣濃度為體積分數0.003。

1.2 載體轉染滋養細胞

構建Cludin-11（CLDN11）過表達慢病毒載體和CLDN11小干擾RNA（siRNA）。靶點設計、載體構建及慢病毒包裝均由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。載體轉染滋養細胞72 h，熒光顯微鏡下觀察，收集細胞匯合度70%～80%、生長狀態良好的細胞進行后續實驗。采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法檢測CLDN11 mRNA的表達水平以驗證轉染效果。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將對數生長期的滋養細胞以每孔4×104個接種于96孔板，每孔接種細胞懸浮液100 μL。將培養板放于培養箱（37 ℃、體積分數0.05 CO2、飽和濕度）中預培養24 h。在細胞培養的48 h加入10 μL CCK-8溶液。在培養箱內孵育1 h后將培養板置酶標儀上測定各孔細胞在450 nm波長下的吸光度值（代表細胞的增殖能力），并繪制細胞的生長曲線。實驗重復3次。

1.4 蛋白印跡法（Western blot）檢測自噬相關蛋白含量

滋養細胞用PBS清洗后加入NP40裂解，提取細胞總蛋白，并測定其濃度。電泳上樣量為 20 μg，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉膜2 h。用封閉液搖床封閉2 h，洗滌后加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，暗室中曝光、顯影并掃描拍照。

1.5 RT-PCR法檢測CLDN11及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路相關基因表達水平

采用TRIzol法提取滋養細胞的總RNA，置于－20 ℃冰箱保存備用。應用北京寶日生物科技有限公司的逆轉錄試劑盒RT regent Kit進行cDNA合成，得到逆轉錄終產物cDNA。應用北京寶日的Takara RR420A TB Green Premix Ex Taq試劑盒進行RT-PCR反應，采用2-△△CT法計算滋養細胞中CLDN11基因以及mTOR通路相關基因mTOR、S6K1的表達水平。

1.6 免疫熒光法檢測自噬相關蛋白表達

用條件培養液處理滋養細胞24 h，收集滋養細胞離心，應用40 g/L多聚甲醛固定1 h，石蠟包埋后切片。切片以PBS洗滌后，用體積分數0.10的山羊血清封閉1 h，接著用體積分數0.002的Tritonx-100浸泡2次，每次10 min。再用LC-3B和β-catenin的一抗37 ℃孵育4 h，加二抗孵育1 h，洗滌切片后進行DAPI染色。應用熒光顯微鏡觀察拍照，進行蛋白半定量分析。

1.7 胎盤外植體培養

用胎盤外植體模擬體內胎盤的生長。取足月剖宮產胎盤，在PBS中徹底洗3次后，將絨毛組織切成小塊（8 mm3），所有操作在30 min內完成。將絨毛組織小塊放入6孔板內，加入含青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養液（每孔4 mL），放入細胞培養箱（37 ℃、體積分數0.05 CO2、飽和濕度）中培養2 d。胎盤外植體用條件培養液處理24 h，以PBS沖洗后放入液氮中保存。

1.8 胎盤外植體CLDN11和Ki67表達檢測

胎盤外植體以石蠟包埋、切片，采用免疫組化法檢測CLDN11和Ki67表達，用PBS替代一抗作為陰性對照。實驗嚴格按照說明書進行操作。

1.9 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料經正態性檢驗符合正態分布，以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 CV-MSC對滋養細胞增殖及自噬的影響

將兩種滋養細胞分為對照組、低氧組及低氧+條培組，分別檢測其生長48 h的吸光度值。結果顯示，低氧組兩種滋養細胞吸光度值較對照組明顯降低，低氧+條培組滋養細胞的吸光度值較低氧組明顯升高，差異均有顯著性（F=51.9、26.9，Plt;0.05）。見表1。

應用低氧及條件培養液處理24 h后，Western blot檢測結果顯示，低氧組兩種滋養細胞內自噬相關蛋白LC-3B、BECN1的表達升高，泛素結合蛋白P62（自噬標志物，與自噬趨勢相反）的表達降低；低氧+條培組滋養細胞內自噬相關蛋白的表達進一步升高，P62蛋白的表達進一步降低。LC-3B的表達免疫熒光法結果與Western blot結果一致。見圖1。

2.2 CV-MSC對滋養細胞內CLDN11表達以及mTOR通路活性的影響

RT-PCR檢測結果顯示，與低氧組比較，低氧+條培組滋養細胞內CLDN11、mTOR以及S6K1的mRNA的表達水平均顯著降低（F=3.9～9.1，Plt;0.01）。

Western blot檢測顯示，與低氧組比，低氧+條培組滋養細胞內上述蛋白的表達水平及mTOR通路相關蛋白的磷酸化水平明顯降低。見圖2。

2.3 siRNA降低CLDN11表達對滋養細胞自噬及增殖的影響

RT-PCR檢測結果顯示，應用CLDN11 siRNA轉染后，與siNC（siRNA陰性對照）組比較，siRNA組滋養細胞內CLDN11、mTOR、S6K1 mRNA的表達水平均明顯降低（t=5.6～15.9，Plt;0.05）。Western blot檢測結果顯示，CLDN11 siRNA轉染后滋養細胞自噬相關蛋白的表達水平明顯上升。應用條件培養液及自噬抑制劑BafA1處理CLDN11 siRNA轉染的滋養細胞24 h，二者對自噬相關蛋白的表達均具有促進作用。見圖3。

細胞培養48 h后CCK-8檢測顯示，siRNA組與siNC組比較，siRNA+BafA1組與siNC+BafA1組比較，siRNA+條培組與siNC+條培組比較，吸光度值均明顯上升，差異有顯著意義（t=4.5～12.0，Plt;0.05）。見表2。

2.4 過表達慢病毒升高CLDN11表達對滋養細胞自噬及增殖的影響

RT-PCR檢測結果顯示，與vec組（模型對照組）相比較，CLDN11組（過表達組）滋養細胞內CLDN11和mTOR通路相關基因的表達明顯升高（t=3.3～11.2，Plt;0.05）。Western blot檢測結果表明，CLDN11過表達后滋養細胞自噬水平明顯下降。見圖4。

CLDN11過表達慢病毒轉染的滋養細胞經條件培養液或者自噬抑制劑BafA1處理24 h后，采用CCK-8法檢測各組滋養細胞的增殖能力，結果顯示，CLDN11組與vec組、CLDN11+條培組比較，CLND11+條培組與vec+條培組比較，吸光度值均明顯下降（t=3.9～10.0，Plt;0.05）；CLDN11組與CLDN11+BafA1組吸光度值比較，差異無顯著性（P＞0.05）。見表3。

2.5 CV-MSC對胎盤外植體自噬及增殖的影響

條件培養液及CLDN11過表達慢病毒處理胎盤外植體48 h，Western blot檢測結果顯示，條件培養液能明顯增加胎盤外植體的自噬水平以及降低CLDN11的蛋白水平，而CLDN11過表達慢病毒轉染升高胎盤外植體內CLDN11表達的同時抑制了這種自噬水平升高。免疫組化法檢測結果表明，條件培養液能明顯降低絨毛細胞內CLDN11的表達強度，而明顯升高Ki67的表達強度。見圖5。

3 討" 論

胎盤的主要功能是由滋養細胞完成的，滋養細胞功能障礙是導致妊娠期高血壓疾病及胎兒生長受限的根本原因［6-7］。滋養細胞功能改善和重建是胎盤異常相關疾病治療的關鍵因素，但目前相關的研

究較少。MSC是間質組織中具有多向分化能力及自我更新能力的祖細胞，越來越多的研究結果表明，MSC能分泌多種細胞因子來促進血管生成，并且其免疫調節、抗炎、促血管生成和抗細胞凋亡的作用使MSC治療成為一種重要的組織修復新療法［8-9］。基于MSC的細胞療法已經成為缺血性疾病最有前途的治療策略之一，多項研究表明，MSC在缺血性心臟病、腎臟損傷和傷口愈合中的治療作用與組織母細胞相似，表明MSC在組織損傷修復治療中具有積極作用［10］。然而，MSC損傷修復治療作用的基礎研究較少，其具體作用機制目前仍不清楚。來源于胎兒及胎盤的MSC較成體干細胞具有更強的免疫調節作用，CV-MSC可以分泌更多的細胞因子，進而幫助調節其他細胞的基本功能［11-12］。目前已知，CV-MSC在許多器官的缺血/低氧、輻射損傷中有修復治療作用，是一種有發展前景的細胞治療資源。本研究評估了CV-MSC對滋養細胞增殖和自噬的調節作用，結果顯示，低氧條件下CV-MSC的條件培養液能夠明顯促進滋養細胞的生長，提高滋養細胞的自噬水平，且伴隨著CLDN11基因表達的下調，這可能是CV-MSC對低氧滋養細胞修復作用的機制。

在跨膜區中表達的Claudin蛋白家族（CLDNs）在緊密連接的基礎上起著關鍵作用，該家族包括大約27個成員，其中大部分可以與含有PDZ的蛋白質緊密結合［13］。這些發現改變了緊密連接單純作為細胞旁屏障的觀點，緊密連接可以是參與控制細胞增殖和分化的信號級聯系統復合體，與多分子復合物和細胞信號轉導途徑有關［14-15］。CLDNs已被證明與細胞增殖、分化和其他細胞功能的調節相關，在大多數組織中均有CLDNs表達，在許多腫瘤類型中都有CLDNs的表達改變［16］。腫瘤細胞通常表現出與正常細胞不同的CLDNs表達譜，并伴隨著細胞的分化和細胞極性的降低［17］。CLDN11位于第3號染色體（3q26.2）上，編碼Claudin家族中一種細胞旁緊密連接膜蛋白，是一個潛在的抑癌基因。有文獻報道，皮膚癌細胞中CLDN11的表達下調，提示癌細胞中緊密連接蛋白的表達與腫瘤侵襲性相關［18］。本文結果表明，CV-MSC可以通過調控滋養細胞內CLDN11的表達促進滋養細胞增殖和自噬，這可能與CLDN11對滋養細胞間連接的調控相關，是CV-MSC細胞療法的重要作用機制之一。

mTOR是細胞生長以及增殖的重要調節因子，mTOR及其介導的信號通路是維持細胞穩態的關鍵，參與免疫抑制，影響轉錄和蛋白合成，調節細胞的生長、凋亡和自噬［19］。自噬是細胞清除損傷、衰老、變性蛋白或細胞器和有毒物質的過程，對細胞生長及穩態維持具有重要作用，尤其在應激及營養缺乏環境中，自噬能幫助細胞生存［20］。自噬的調控十分復雜，mTOR通路作為細胞營養、應激和生長信號的傳感器通路，在自噬的調節中起非常重要的作用［21］。研究發現，激活mTOR可以抑制細胞自噬，而抑制mTOR能誘導細胞發生自噬［22］。營養缺乏時，營養缺乏信號可以通過AMPK途徑或通過其他間接途徑作用于mTOR，并抑制其活性，導致細胞發生自噬；營養充足時，mTOR通路激活并繼續活化下游因子，促進細胞蛋白質合成，進而促進細胞增殖和代謝，抑制自噬。本研究結果表明，在低氧環境下CV-MSC能明顯促進滋養細胞的生長，同時伴隨著滋養細胞自噬的明顯激活和mTOR通路的抑制，

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青 島 大 學 學 報 （醫 學 版）59卷

提示CV-MSC對滋養細胞的生長促進作用可能是通過激活低氧條件下的自噬實現的。

綜上所述，胎盤來源的CV-MSC可以通過增強自噬促進滋養細胞的增殖，這種促進作用可能是通過調節滋養細胞內CLDN11的表達及下游mTOR通路實現的。CV-MSC作為一種非常重要的細胞治療資源，其作用機制的研究對于細胞治療的應用至關重要。本文結果對于滋養細胞功能障礙導致的胎盤相關疾病的病因探討也具有重要意義，對MSC相關療法的進一步研究給胎盤相關疾病治療帶來了新的希望。

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（本文編輯 馬偉平）