旋毛蟲感染早期誘導小鼠腸道病理變化及免疫調節相關細胞因子表達變化的研究

摘 要：為了分析旋毛蟲感染早期如何誘導腸道病理變化及免疫調節相關細胞因子表達變化，采用流式細胞術、酶聯免疫吸附測定（ELISA）等方法比較小鼠不同時間段細胞因子和細胞比例的指標，采用蘇木素伊紅染色法顯示不同時間節點的腸道病理變化情況。結果顯示，實驗組感染7天免疫細胞比例顯著低于對照組，第7天、第14天IL-10、IL-4、IFN-γ均顯著高于對照組；在腸道病理變化方面，感染12 h后腸道組織發生炎性細胞浸潤，24 h后腸道組織開始黏膜水腫，至72 h逐漸嚴重，浸潤的炎性細胞也逐漸增多。由此可見，旋毛蟲感染早期能誘導腸道發生病理性變化，同時隨著感染時間的延長，體內免疫調節相關細胞因子指標變化更加明顯。

關鍵詞：旋毛蟲；腸道；病理變化；免疫調節；細胞因子

旋毛蟲感染宿主會導致嚴重的人獸共患傳染性疾病—旋毛蟲病，對人類及動物的身體健康產生極大的危害，并給社會經濟造成嚴重的負擔[1-2]。旋毛蟲在入侵宿主之后會產生一定的免疫反應，同時宿主在被誘導產生獲得性免疫反應之后，不能有效抑制旋毛蟲在體內繼續生存和發育，宿主長期處于感染狀態，說明宿主所產生的免疫反應無法有效抑制和殺滅旋毛蟲。也有研究結果表明，旋毛蟲通過自身分泌的蛋白來進一步發揮寄生以及入侵作用，其整個免疫作用機制是入侵和寄生的主要因素[3]。同時，在誘導宿主進行相關免疫反應的過程中，所產生的免疫因子、細胞因子對自身免疫性疾病、惡性腫瘤、過敏性疾病等人體自身的疾病具有一定的作用，這也在另一層面上為人類免疫系統疾病的治療提供了創新思路[4]。

1 " 實驗材料與方法

1.1 "實驗材料

旋毛蟲蟲株選取SD大鼠保種的旋毛蟲，由吉林大學動物科學學院寄生蟲實驗室提供；實驗動物選取BALB/C鼠，均為雌性，體重在20 g，普通級，購于長春市生物制品所實驗動物中心。

1.2 "實驗方法

1.2.1 "旋毛蟲蟲體的制備

成年SD大鼠10只，經口灌胃旋毛蟲肌肉200條/只，于感染后第5天禁食、第6天乙醚麻醉后斷頸處死，立即剖腹取出十二指腸及小腸，縱向剖開剪成小段，放入盛有37 ℃含雙抗生理鹽水的培養皿中，吸去腸內容物，加入盛有37 ℃預溫生理鹽水的燒杯中，放入37 ℃、5% CO2培養箱中孵育4～5 h，待成蟲主動從小腸黏膜鉆出，經37 ℃預熱的含雙抗磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）洗滌一次，再于培養箱中靜置20～30 min，棄上清液收集成蟲，然后用不含抗生素的預熱PBS洗3次，并在每次洗后于37 ℃培養箱中靜置20～30 min，最后用含有20%胎牛血清的RPM1-1640培養液洗一次，靜置沉淀，用吸管沿壁小心吸去上清液，留少量培養液輕輕混勻，顯微鏡下觀察活力并計數。

1.2.2 "模型的建立

將制備好的旋毛蟲蟲體經口感染小鼠，每只小鼠灌胃約300條。對照組給予相對應的生理鹽水。

在解剖鏡下明確感染旋毛蟲后，制備不同時間段小鼠腸系膜、脾臟細胞的混懸液，制備好小鼠脾臟及腸系膜淋巴結后，使用PBS進行多次洗滌，然后使用無菌玻璃棒搗碎，將制備好的混懸液轉移至離心管，加入培養液之后，進行離心分層去沉淀物，再次加入5 mL 1640培養液，然后繼續離心，去掉上清液之后，加入10 μL臺盼藍染色液，混勻后，取20 μL加入計數板中，在細胞計數儀上測定細胞濃度并記錄。同時，剝離小鼠腸道黏膜，然后制備病理切片[5]。

1.3 "觀察指標

（1）不同時間段Th1、Treg、Th17等免疫細胞比例的變化情況。

（2）IL-10、IL-4、IFN-γ等細胞因子變化情況。

（3）不同時間節點的腸道病理變化情況。

1.4 "統計學方法

收集數據后，使用SPSS26.0進行統計分析，組間比較采用T檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 " 結果

2.1 "不同時間段Th1、Treg、Th17等免疫細胞比例的變化情況

感染組和對照組第1天的Th1、Treg、Th17等免疫細胞比例比較無顯著差異（P＞0.05）；第7天、第14天感染組的Th1、Treg、Th17等免疫細胞比例顯著低于對照組，如表1所示。

2.2 "不同時間段細胞因子變化情況

第7天感染組的IL-10為60.29±8.21、IL-4為113.24±9.01、IFN-γ為236.33±25.12，高于第7天對照組的IL-10（29.11±0.28）、IL-4（59.09±6.11）、IFN-γ（61.79±6.30），差異顯著（P＜0.05）；第14天感染組的IL-10為93.59±8.21、IL-4為134.88±8.21、IFN-γ為432.38±52.23，高于第14天對照組的IL-10（29.10±0.32）、IL-4（57.18±6.22）、IFN-γ（61.19±7.29），差異顯著（P＜0.05），如表2所示。

2.3 "不同時間節點的腸道病理變化情況

在不同時間節點的腸道病理變化實驗中，A為對照組；B為感染12 h后腸道組織發生炎性細胞浸潤情況，浸潤的炎性細胞明顯增多；C為感染24 h后腸道組織黏膜發生水腫情況；D為感染48 h后腸道黏膜發生損傷情況，且損傷程度較為嚴重，肉眼可見炎性細胞增多；E為感染72 h后腸道黏膜嚴重受損情況，肉眼可見黏膜下的炎性細胞浸潤更多，伴有嚴重的水腫，如圖1所示。

3 " 討論

旋毛蟲發生感染后會導致小鼠體內產生一系列的免疫反應，這些免疫反應會進一步調動機體的免疫細胞和體內的炎癥因子。相關研究表明，發生感染后，體內的Treg細胞會發生很明顯的變化，同時通過Treg細胞可以進一步影響宿主的免疫應答。旋毛蟲感染宿主的3個致病時期分別為侵入期、幼蟲移行期、囊包形成期。了解這3個致病時期的免疫特征有助于理解旋毛蟲病的免疫病理機制和研究旋毛蟲病防治方法[6-7]。本研究發現，感染組和對照組第1天的Th1、Treg、Th17等免疫細胞比例比較無顯著差異（P＞0.05）；第7天、第14天感染組的Th1、Treg、Th17等免疫細胞比例低于對照組，差異顯著（P＜0.05）；第7天、第14天感染組的IL-10、IL-4、IFN-γ高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。在腸道病理變化方面，感染12 h后，腸道組織發生炎性細胞浸潤；感染24 h后，腸道組織的黏膜發生水腫，同時浸潤的炎性細胞明顯增多；感染48 h后，腸道的黏膜發生損傷，且損傷程度較為嚴重，肉眼可見炎性細胞增多；感染72 h后，腸道黏膜受損嚴重，肉眼可見黏膜下的炎性細胞浸潤更多，伴有嚴重的水腫。分析其原因主要是血清中IFN-γ水平與脾臟及腸系膜淋巴結中Th1細胞的比例急劇升高，這可能與新生幼蟲的產生相關。IFN-γ參與針對新生幼蟲的免疫，主要機制是IFN-γ可增強中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及活化巨噬細胞介導的細胞毒性作用，宿主通過上調Th17細胞比例，在一定程度上增強腸道平滑肌的收縮能力，促進蟲體的清除，Th17細胞一方面可通過分泌細胞因子抵抗細菌、真菌及蠕蟲的感染，另一方面可通過促進中性粒細胞募集及炎癥因子的釋放而導致炎癥。綜上，旋毛蟲感染早期能誘導腸道發生病理性改變，同時隨著感染時間的延長，體內的Th1、Treg、Th17、IL-10、IL-4、IFN-γ等細胞因子和細胞比例的指標變化更加明顯。

[參考文獻]

[1]顏景海，呂芳麗.半乳糖凝集素-受體相互作用對旋毛蟲感染小鼠腸道黏膜免疫的調節[J].熱帶醫學雜志，2021（5）：540-543，622.

[2]常遇晴，鐘秋婷，侯永恒，等.慢性旋毛蟲感染對伯氏瘧原蟲共感染小鼠肝臟免疫病理的調節作用[J].中華地方病學雜志，2021（5）：368-373.

[3]杜素琴，祝幸，于艷，等.PD-1在旋毛蟲感染所致小鼠小腸與骨骼肌組織病理學改變中的作用[J].寄生蟲與醫學昆蟲學報，2021（1）：8-13.

[4]劉昊，楊雪嬌，李曉云，等.旋毛蟲感染對小鼠脾樹突狀細胞吲哚胺2，3-雙加氧酶表達的影響[J].中國獸醫科學，2021（3）：331-336.

[5]ZHANG Z J，ZHANG X Z，YAN R.Vaccination of mice with recombinant novel aminopeptidase P and cathepsin X alone or in combination induces protective immunity against Trichinella spiralis infection[EB/OL].（2021-09-09）[2023-02-20].https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34508714/.

[6]黃京京，呼延旭，莊清慧，等.旋毛蟲感染經PD-1途徑對BCG免疫小鼠細胞因子產生的影響[J].寄生蟲與醫學昆蟲學報，2019（3）：137-144.

[7]周亞蘭，陶志勇，劉曉婕，等.囊包形成初期旋毛蟲感染小鼠脾臟分泌白細胞介素-22的淋巴細胞來源分析[J].中華地方病學雜志，2019（6）：458-462.