肺泡灌洗液MP-DNA聯合血清特異性免疫球蛋白M檢測在兒童肺炎支原體感染診斷中的價值研究

【摘要】 目的 研究肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）" MP-DNA聯合血清特異性免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）檢測在兒童肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）感染診斷中的價值。方法 回顧性分析2019年1月—2022年1月于東阿縣人民醫院治療的116例MP感染患兒的臨床資料。患兒入院后24 h內采集外周靜脈血2 mL并立即送檢，于入院后24～48 h經喉罩或氣管插管將支氣管鏡置入氣管、支氣管內，獲取BALF放置細菌培養瓶內，并快速送檢，分別進行血清MP-IgM檢測、BALF MP-DNA檢測。對比BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項及聯合診斷MP效果。結果 BALF MP-DNA與血清MP-IgM聯合診斷MP陽性率（92.24%）高于BALF MP-DNA（77.59%）與血清MP-IgM（46.55%）單項診斷MP陽性率，BALF MP-DNA診斷MP陽性率高于血清MP-IgM檢測，差異有統計學意義（Plt;0.05）。結論 BALF MP-DNA聯合血清MP-IgM檢測診斷MP感染陽性率較高，可為MP感染早期診斷及用藥治療提供參考。

【關鍵詞】 肺炎支原體感染；肺泡灌洗液MP-DNA；免疫球蛋白

中圖分類號：R725" " " " 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）32-0070-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.32.024

肺炎支原體（MP）是學齡期兒童和青少年社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的主要病原體，需住院治療的肺炎患兒中MP感染占20%左右。近年來MP感染率有逐年上升趨勢，且少數MP感染所致的肺炎病程長，癥狀嚴重，往往出現肺外表現，甚至遺留肺部損傷，重者危及生命[1]，故盡早診斷MP感染并進行早期治療顯得尤為重要。MP感染早期肺部體征不明顯，臨床癥狀及胸部影像學檢查缺乏特異性，故明確診斷MP感染往往需要依賴病原學檢查。血清MP-IgM的測定方法簡單且耗時較短，MP-IgM一般在感染后7～10 d內才會出現，在體內留存時間長，但在早期輕度感染、存在免疫系統缺陷、發育不完善的患者中可能無MP-IgM抗體產生[2]。近年來，支氣管鏡檢查在兒科領域不斷應用，通過支氣管鏡進行氣道及肺泡灌洗，可從支氣管肺泡灌洗液（BALF）中獲取病原學及炎癥細胞分類等多種信息，為某些肺部疾病的診斷提供信息[3]。鑒于此，本研究探討了BALF MP-DNA聯合血清特異性IgM檢測在兒童MP感染診斷中的價值，以期為臨床早期診治MP感染提供指導，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年1月—2022年1月于東阿縣人民醫院治療的116例MP感染患兒的臨床資料。患兒中男性67例，女性49例；年齡1～13歲，平均年齡（6.57±1.20）歲。

1.2 入選標準 納入標準：患兒臨床資料完整；患兒伴有呼吸道感染癥狀，且MP培養呈陽性；能夠耐受支氣管鏡檢查。排除標準：合并先天性心臟病；合并出血性疾病；存在免疫缺陷或其他原發疾病、慢性疾病；合并哮喘、肺結核及慢性肺疾病等。

1.3 方法 支氣管鏡檢查及BALF留取的相關注意事項：向患兒家屬告知檢查的必要性及相關注意事項，詢問患兒家屬既往病史、近日是否有用藥史，核實有無檢查禁忌證，檢查前完成心電圖、凝血功能及血分析等相關檢查。術前6 h禁食、2 h禁水，詢問有無麻醉藥物過敏史，包括咪達唑侖、丙泊酚等，手術當天完成血清特異性IgM檢測，告知患兒家屬在支氣管鏡檢查結束后至少留觀1 h。為了避免污染標本，檢查中嚴格遵循無菌操作原則，避免對患兒氣道造成不必要的傷害，操作者要注意操作動作。

標本采集：患兒入院后24 h內采集外周靜脈血2 mL并立即送檢，同時在患兒入院24～48 h經喉罩、氣管插管將支氣管鏡置入氣管、支氣管內，支氣管鏡到達病變處后，經內鏡工作孔道注入37 ℃ 0.9%氯化鈉注射液，通過負壓100～200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的吸引器吸引獲取BALF至細菌培養瓶內，并快速送檢，均為全麻下支氣管鏡檢查灌洗。

血清特異性IgM的檢測：采用1∶10歐蒙吸附劑稀釋患者樣本，以2 000 r/min離心5 min。加樣，即將歐蒙配套的加樣板放置在其支撐的泡沫板上，取30 μL稀釋后的樣本放于加樣板的實驗反應區上；溫育，即從冰箱內提前取出生物載片，恢復至室溫后撕開封袋，手持生物載片的兩端，將生物載片有生物薄片的一面朝下，載片左下邊沿有一凹進卡槽可與加樣板上相對應凸起設計對應，凹槽緊密對合，將生物載片蓋在加有樣本的反應板上，基質完全浸泡于樣本中，室溫避光條件下溫育30 min；沖洗，即從反應板上取下生物載片，沖洗載片上殘存的樣本，再將生物載片放置玻片放置槽內，緩沖液浸泡5 min，浸泡時基質面朝上，或立起，2張生物載片應間隔放置，加熒光二抗，同第一步加樣相同，取30 μL FITC標記的熒光二抗加至潔凈加樣板的反應區，取出浸泡5 min的生物載片，再用吸水紙擦去生物載片背面和4個邊緣的水分，后迅速蓋于熒光二抗上，與加樣板上相對應的凹槽緊密對合，室溫避光溫育30 min，再次沖洗浸泡；封片，即取出浸泡好的生物載片并用吸水紙去除多余的水分，同上步，后將基質面朝上平放至工作臺，在各個反應區滴加10 μL封片介質，蓋玻片蓋上。

血清特異性IgM的結果判定：在熒光顯微鏡下判讀，主要在感染細胞胞漿內產生顆粒細到粗的滴狀熒光，根據感染的嚴重程度不同，在一些細胞中可出現細到粗顆粒狀熒光，感染比較嚴重的細胞可產生粗的滴狀熒光，有些部位可見平滑的熒光。

肺泡灌洗液MP-DNA的檢測：主要采用恒溫擴增技術的環介導恒溫擴增法，即DNA在65 ℃左右處于動態平衡狀態，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈的雙鏈結構就會解離成單鏈。根據靶序列的封閉區域設計其特異的引物，MP的檢測選擇6個區域設計出4條特異引物，包括2條內引物和2條外引物，在DNA聚合酶的作用下，在恒定溫度下DNA不斷復制擴增，其反應過程包括啞鈴狀模板合成、循環擴增、伸長和再循環3個重要階段，最終形成DNA片段混合物。采用碟式芯片技術（博奧生物集團設計生產），根據需要檢測的病原體種類、各病原體的特定檢測區域，每張碟式芯片上設有多個反應池，根據檢測需要特異每個反應池包埋固定一套引物用于一種病原體的特異核苷酸靶序列的擴增與檢測，對實驗標本進行前處理及DNA提取，加入擴增試劑與提取的DNA混合后注入芯片，并通過離心方式均勻分配到各個反應池。

肺泡灌洗液MP-DNA的判定標準：芯片的各個反應池相對獨立，并同時進行恒溫擴增反應，在擴增過程中實時進行熒光信號的收集檢測，某反應池若檢測到熒光信號的變化則能及時捕獲，將熒光信號的強弱記錄在擴增過程的時間軸上，若熒光信號增強，各個檢測點形成的擴增曲線繪成標準的“S”形，提示該反應池對應的特異病原體的特異核苷酸靶序列為擴增陽性。

1.4 評價指標 對比BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項及聯合診斷MP效果，其中聯合診斷中BALF MP-DNA與血清MP-IgM中任意一項陽性即可判斷為陽性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件分析數據，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項及聯合診斷MP效果：BALF MP-DNA+血清MP-IgM聯合診斷MP陽性率高于BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項診斷MP陽性率，BALF MP-DNA診斷MP陽性率高于血清MP-IgM檢測，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

3 討論

MP是目前所發現的最小原核微生物，它缺乏細胞壁，對呼吸道上皮細胞有較高的親和性，MP主要通過飛沫經呼吸道進行傳播，全年均可發病，但以秋冬季較多，學齡期兒童的MP感染率較高[4]。MP感染不僅會引發呼吸系統疾病，還會誘發心血管系統、血液系統及神經系統等肺外系統的損害[5]。近年來，隨著重癥或難治性的支原體肺炎的發生率不斷升高，引起了兒內科醫師的廣泛關注，故實時、高效的實驗室診斷方法是診斷MP感染的主要依據。支原體感染早期治療至關重要，但目前尚不能通過臨床或影像學表現明確區分MP、衣原體肺炎以及病毒性肺炎[6]。

目前MP實驗室診斷方法主要包括病原培養、血清學檢測、免疫色譜測試（in-circuit test，ICT）及聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術等[7]。MP培養被認為是診斷的金標準，但時間長達6周的要求，讓專門的培養基和訓練有素的技術人員限制了MP培養在臨床實踐中的使用[8]。病原體誘導的免疫反應導致抗體的產生，是當前臨床中使用最為廣泛的MP檢測方法，目前主要檢測IgA、IgM、IgG。MP-IgM是MP感染后機體最早產生的抗體，在感染MP后的1周可出現IgM抗體并在血中可檢測到，3～4周后達到高峰，隨后逐漸下降，并可持續數月[9]。但MP-IgM的出現與多種因素有關，可能由于早期MP-IgM抗體水平不足，或患兒免疫功能低下，不足以產生足夠的抗體，導致早期診斷時經常出現假陰性結果，故臨床單獨檢測血清MP-IgM具有一定的局限性。近年來電子支氣管鏡在臨床診療中不斷應用，支氣管肺泡灌洗（BAL）已成為治療呼吸系統疾病的重要手段，有利于直觀觀察病變部位，并可進行鉗夾、局部注藥，通過BAL促進黏稠分泌物的排出[10]。同時還可直接采集灌洗液標本進行免疫學及病原學的檢查，獲取細胞學、可溶性蛋白酶類、細胞因子及生物活性介質等多種信息，為診斷肺部感染性疾病等肺部疾病提供參考[11]。本次研究結果顯示，BALF MP-DNA+血清MP-IgM聯合診斷MP陽性率高于BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項診斷MP陽性率，BALF MP-DNA診斷MP陽性率高于血清MP-IgM檢測。提示BALF MP-DNA+血清MP-IgM聯合診斷MP陽性率較高，能夠彌補BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項診斷MP的不足，臨床診斷MP感染證據更為充分，為臨床早期診斷MP感染提供雙重依據，使MP早期診斷及正確選擇抗生素治療成為可能。BAL手術簡便、患兒耐受性好且并發癥少見，檢測結果不受機體免疫、年齡及感染程度的影響，有利于早期準確檢測到MP感染[12]。但由于BALF獲取標本方式屬于有創操作，臨床應用受到了一定的限制。

綜上所述，學齡期兒童的MP感染率最高，采用BALF MP-DNA聯合血清MP-IgM檢測可提高MP感染診斷陽性率，降低MP感染的漏診率，為MP感染早期診斷及用藥治療提供參考。

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