circRNA_0031269調控miR-127-3p影響宮頸癌細胞的增殖及遷移

【摘要】 目的 探討circRNA_0031269調控miR-127-3p影響宮頸癌細胞的增殖及遷移。方法 選取深圳市南山區前海蛇口自貿區醫院2020年3月—2021年4月婦科腫瘤專科收治的40例宮頸癌患者，經手術治療切除的癌組織和癌旁組織。采用實時熒光定量聚合酶聯反應（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測不同組織中circRNA_0031269和miR-127-3p的相對表達；雙熒光素酶報告基因檢測觀察circRNA_0031269和miR-127-3p的靶向關系。采用MTT、Transwell細胞實驗檢測宮頸癌細胞增殖、遷移能力。結果 癌組織中circRNA_0031269表達高于癌旁組織，miR-127-3p表達低于癌旁組織（Plt;0.05）；miR-127-3p過表達可降低WT-circRNA0031269的熒光酶活性，與anti-miR-NC組比較，差異具有統計學意義（Plt;0.05）；anti-miR-127-3p過表達可抑制HeLa細胞增殖、遷移，與anti-miR-NC組比較，差異具有統計學意義（Plt;0.05）；抑制circRNA_0031269表達可抑制HeLa細胞增殖、遷移，上調miR-127-3p表達，與si-NC組比較，差異具有統計學意義（Plt;0.05）。結論 circRNA0031269可通過上調miR-127-3p表達降低宮頸癌HeLa細胞的增殖和遷移。

【關鍵詞】 宮頸癌；CircRNA_0031269；MiR-127-3p；遷移

Effect of circRNA_0031269 by regulating miR-127-3p on the proliferation and migration of cervical cancer cells

Qiao Min，Huang Shufeng，Wu Yanling. Department of Gynecology，Qianhai Shelcon Free Trabe Zone Hospital，Nanshan District，Shenzhen，Guangdong 518000

【Abstract】 Objective To investigate the effect of miR-127-3p regulated by circRNA_0031269 on the proliferation and migration of cervical cancer cells. Methods From March 2020 to April 2021，40 patients with cervical cancer who were admitted to the Department of gynecological oncology in Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital of Nanshan District， Shenzhen were selected for surgical resection of cancer tissues and adjacent tissues. Real time fluorescence qRT-PCR was used to detect circrna in different organizations circRNA_0031269 and miR-127-3. Bouble luciferase reporter gene assay circRNA_0031269 and miR-127-3p. MTT and Transwell cell assay were used to detect the proliferation and migration of cervical cancer cells. Results The expression of circRNA_0031269 was higher and the expression of miR-127-3p was lower in cancer tissues than in adjacent tissues（Plt;0.05）. MiR-127-3p overexpression decreased the luciferase activity of WT-circRNA_0031269， which was significantly different from the anti-miR-NC group（Plt;0.05）. Anti-miR-127-3p overexpression inhibited HeLa cell proliferation and migration；compared with the anti-miR-NC group，the difference was statistically significant（Plt;0.05）. Inhibition of circRNA_0031269 expression inhibited HeLa cell proliferation， migration，and up-regulated miR-127-3p expression；compared with the si-NC group，the difference was statistically significant（Plt;0.05）. Conclusion CircRNA_0031269 can reduce the proliferation and migration of HeLa cells by up-regulating the expression of miR-127-3p.

【Key Words】 Cervical cancer； CircRNA_0031269； MiR-127-3p； Migration

中圖分類號：R737.33" " " "文獻標識碼：A" " " " 文章編號：1672-1721（2023）32-0061-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.32.021

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，也是導致全球范圍內女性死亡的重要原因，嚴重影響女性生活質量及生命安全[1]。癌細胞的增殖、遷移和侵襲是導致死亡的重要因素，因此尋找影響宮頸癌細胞增殖、遷移的相關機制有助于提高臨床診斷及療效。環狀RNA（circRNA）屬于閉合環狀類RNA分子，具有較好的穩定性，可充當miRNA海綿分子與RNA結合蛋白相互作用，從而調控miRNA，參與細胞增殖、凋亡等過程[2-3]。既往研究顯示circRNA表達參與宮頸癌疾病的發生及發展，可作為宮頸癌治療靶點及潛在標志物[4]。本研究旨在為宮頸癌發病機制與臨床治療提供新思路，觀察circRNA_003126和miR-127-3p在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達情況，探索circRNA_003126對miR-127-3p的調控作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取深圳市南山區前海蛇口自貿區醫院2020年3月—2021年4月婦科腫瘤專科收治的40例宮頸癌患者經手術治療切除的癌組織和癌旁組織（距病灶gt;3 cm），-80 ℃保存。患者年齡44～68歲，平均年齡（57.19±8.32）歲，均為宮頸鱗癌。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

納入標準：經影像學及組織病理學確診，符合《宮頸癌診療規范》[5]相關診斷標準；入組前均為初次手術治療者。

排除標準：入組前已進行放化療、免疫治療及藥物等治療者；伴有其他宮頸病變及婦科疾病患者；合并其他腫瘤患者。

1.2 實時熒光定量聚合酶聯反應（qRT-PCR） 檢測宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中circRNA_0031269和miR-127-3p的表達。取患者癌組織及癌旁組織樣本，采用TRIzol試劑盒提取總RNA，并根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，反應條件95 ℃預變性2 min，95 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循環40次。以SYBR Green PCR試劑盒說明書對目標基因擴增，使用 2-ΔΔCT方法計算目標基因相對表達量。試劑盒均購于賽默飛世爾科技有限公司[6]。

1.3 雙熒光素酶報告基因檢測 通過circRNA_0031269和miR-127-3p的靶基因構建雙熒光素酶報告基因載體WT-circRNA_0031269、MUT-circRNA_0031269、miR-127-3p-mimics、miR-NC-mimics，每組設置9孔，按照3×104 個/孔的密度將HeLa細胞接種于96孔板（100 μL/孔），24 h后轉染miR-127-3p-mimics或miR-NC-mimics和WT-circRNA_0031269或MUT-circRNA_0031269，48 h后收集細胞并檢測熒光素酶活性[7]。

1.4 MTT細胞增殖實驗 按照3×104個/孔的密度將HeLa細胞接種于96 孔板（100 μL/孔）中，每組設置9孔，anti-miR-NC、anti-miR-127-3p、si-NC、si-circRNA_0031269加入200 μL無血清DMEM培養基混合均勻，加入16 μL Lipofectamine 2000 后室溫靜置5 min，HeLa細胞與各轉染物5% CO2培養箱內37 ℃培養48 h。取生長良好的細胞于96孔板中加入20 μL/孔的MTT溶液，CO2培育箱，37 ℃孵育4 h棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光室溫孵育90 min后置于490 nm酶標儀讀取吸光度（optical density，OD）值。

1.5 Transwell細胞遷移實驗 取生長良好的細胞于96孔板中轉染36 h，200 μL/孔胰酶消化，培養基終止消化后行離心操作，棄培養液，PBS清晰5 min×2。采用無血清培養基制備細胞混懸液，接種至Transwell小室膜上室每孔細胞數（2～5）×104個，小室膜下室加入10%胎牛血清DMEM培養液，37 ℃培養24 h后采用多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞遷移數。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件分析數據，計量資料符合正態分布以x±s表示，2組間差異比較采用t檢驗分析，Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者circRNA_0031269和miR-127-3p的表達 癌組織中circRNA_0031269表達高于癌旁組織，miR-127-3p表達低于癌旁組織（Plt;0.05），見表1。

2.2 雙熒光素酶報告基因檢測結果 miR-127- 3p過表達可降低WT-circRNA_0031269的熒光酶活性，與anti-miR-NC組比較，差異具有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.3 miR-127-3p過表達對HeLa細胞增殖、遷移的影響 anti-miR-127-3p過表達可抑制HeLa細胞增殖、遷移，與anti-miR-NC組比較，差異具有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

2.4 抑制circRNA_0031269對HeLa細胞增殖、遷移的影響 抑制circRNA_0031269可上調miR-127- 3p表達，抑制HeLa細胞增殖、遷移，與si- NC組比較，差異具有統計學意義（Plt;0.05），見表4。

3 討論

宮頸癌作為原發子宮頸部位惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續感染可引起病情發展。近年來廣泛的宮頸癌篩查使宮頸癌早期發現率提高，發病率和病死率逐漸下降，同時呈現發病年輕化趨勢。癌細胞的增殖和遷移是宮頸癌患者治療的重要障礙，使晚期宮頸癌患者5年生存率僅為10%左右[8-10]。有研究表明，circRNA和miRNA的表達與宮頸癌的發生、發展相關，且存在circRNA靶向調控miRNA機制[11]。在多項研究中，circRNA_0011021、circRNA_100269在宮頸癌組織中的表達，以及對宮頸癌細胞的增殖、遷移及細胞生物學特征等均具有影響，說明circRNA可參與宮頸癌病理、生理過程，并在疾病的發生發展中發揮重要作用[12-13]。miRNA是基因表達的轉錄后調控因子，參與包括細胞生長、增殖、分化等生物進程，其中miR-127-3p在多種癌癥中發揮重要作用，可通過調控靶基因結合使靶蛋白水平降低，從而發揮抑制癌細胞增殖、遷移等作用[14]。

本研究通過對40例宮頸癌患者癌組織及癌旁組織取樣，發現宮頸癌組織中circRNA_0031269表達高于癌旁組織。同時結果顯示，miR-127-3p在癌旁組織中表達水平較在宮頸癌組織中的表達水平高，提示miR-127-3p在抑制腫瘤的發生中具有重要意義，或可能作為臨床宮頸癌治療的新靶點，為宮頸癌診斷提供重要的生物標志和新思路。本研究結果證實，在宮頸癌疾病中circRNA_0031269存在靶向調控miR- 127-3p機制，且miR-127-3p過表達可降低WT-circRNA_0031269的熒光酶活性。通過MTT、Transwell細胞實驗檢測本研究結果顯示，miR-127-3p過表達可降低HeLa細胞OD值及遷移細胞數量，提示miR-127-3p過表達可抑制HeLa細胞增殖、遷移。抑制circRNA_0031269表達可上調miR-127-3p表達，并抑制HeLa細胞增殖、遷移。上述結果提示，circRNA_0031269和miR-127-3p參與宮頸癌細胞的增殖和遷移，宮頸癌細胞與其表達水平密切相關。

綜上所述，circRNA_0031269和miR-127-3p表達在宮頸癌細胞的增殖和遷移中具有重要意義，circRNA_0031269可通過調控miR-127-3p升高，而降低宮頸癌HeLa細胞的增殖、遷移。但仍需完善circRNA_0031269調控miR-127-3p的關系對宮頸癌細胞發展的影響，以及通過動物實驗驗證circRNA_0031269與miR-127-3p分子軸在宮頸癌疾病中的作用機制。

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