高良姜素減輕異丙腎上腺素誘導心臟纖維化的作用機制

摘要 目的：探討高良姜素（Galangin）對異丙腎上腺素（ISO）誘導心臟纖維化的作用機制。方法：將30只C57BL/6小鼠隨機分為正常組、ISO組、高良姜素低劑量組［25 mg/（kg·d）］、高良姜素中劑量組［50 mg/（kg·d）］、高良姜素高劑量組［100 mg/（kg·d）］。處理結束后行心臟超聲評估心功能［左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD）］；測量小鼠體質量（BW）、心臟重量（HW）、脛骨長度（TL），計算心臟重量與體質量比值（HW/BW）、心臟重量與脛骨長度比值（HW/TL），評估心肌肥厚情況。天狼星紅染色評價心臟纖維化程度；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測炎癥標志物白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和纖維化標志物膠原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）、膠原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）mRNA水平；試劑盒檢測心臟組織氧化應激指標超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。結果：與正常組比較，ISO組小鼠HW/BW、HW/TL、LVEDD及LVESD升高，LVEF和LVFS降低，IL-6、IL-1β、TNF-α、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β1 mRNA表達水平升高，心臟SOD和CAT活性降低，MDA含量升高，心肌細胞橫截面積增大，心臟纖維化面積增加（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟纖維化面積減小，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、IL-6 mRNA表達水平降低，SOD活性升高，MDA含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。高良姜素中劑量組TGF-β1低于ISO組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：高良姜素可減輕ISO誘導的心臟纖維化，其機制可能與抑制炎癥、氧化應激有關。

關鍵詞 心臟纖維化；高良姜素；異丙腎上腺素；炎癥；氧化應激；小鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.24.009

Mechanism of Galangin on Isoprenaline-induced Cardiac Fibrosis

SHANG Ruru， TONG Manlin， LIU Xiaohong

Shanxi Provincial People′s Hospital， Taiyuan 030012， Shanxi， China

Corresponding Author LIU Xiaohong， E-mail： docliuxh@163.com

Abstract Objective：To investigate the mechanism of Galangin on isoprenaline（ISO）-induced cardiac fibrosis.Methods：Thirty C57BL/6 mice were randomly divided into the normal group，ISO group，low-dose galangin group［25 mg/（kg·d）］，medium-dose galangin group ［50 mg/（kg·d）］，and high-dose galangin group ［100 mg/（kg·d）］.After treatment，cardiac ultrasound was performed to detect cardiac function ［left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular short-axis shortening（LVFS），left ventricular end-systolic internal diameter（LVESD），and left ventricular end-diastolic internal diameter（LVEDD）］.The body mass（BW），heart weight（HW），and tibia length（TL） of the mice were measured，and the heart weight-weight to body mass ratio（HW/BW） was detected，and the heart weight to tibia length ratio（HW/TL）were collected to assess cardiac hypertrophy.The degree of cardiac fibrosis was detected by sirius scarlet staining.The inflammatory markers interleukin-6（IL-6），interleukin-1β（IL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α），and fibrotic markers collagen Ⅰ（Collagen Ⅰ），collagen Ⅲ（Collagen Ⅲ），transforming growth factor-β1（TGF-β1） mRNA levels were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qPCR）.The kit was used to detect the oxidative stress indicators superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT） activity，and malondialdehyde（MDA） content in heart tissue.Results：Compared with the normal group，HW/BW，HW/TL，LVEDD，and LVESD in the ISO group were higher，LVEF and LVFS were less，levels of IL-6，IL-1β，TNF-α，Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，and TGF-β1 mRNA were higher，SOD and CAT activities were less，and MDA content was higher.The cardiomyocyte cross-sectional area and cardiac fibrosis area were higher（P＜0.05）.Compared with the ISO group，the area of cardiac fibrosis was less in the high-dose galangin group，the expression levels of Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，and the mRNA of IL-6 were less，the activity of SOD was higher，and the content of MDA was less（P＜0.05）.TGF-β1 in the medium-dose galangin group was less than that in the ISO group（P＜0.05）.Conclusion：Galangin could alleviate isoproterenol-induced cardiac fibrosis，and its mechanism might be related to inhibiting inflammation and oxidative stress.

Keywords cardiac fibrosis; Galangin; isoproterenol; inflammation; oxidative stress; mice; experimental study

心力衰竭是心血管疾病的終末階段，發病率及死

基金項目 山西省衛生健康委科研課題項目（No.2021112）

作者單位 1.山西省人民醫院（太原" 030012）；2.山西醫科大學第五臨床醫學院

通訊作者 劉曉紅，E-mail：docliuxh@163.com

引用信息 尚茹茹，童曼琳，劉曉紅.高良姜素減輕異丙腎上腺素誘導心臟纖維化的作用機制［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2023，21（24）：4524-4529.

亡率均較高，心力衰竭發生機制復雜，尚未明確。目前認為神經內分泌系統激活導致的心室重塑是引起心力衰竭的關鍵因素，心臟纖維化是心室重塑的主要病理特征，炎癥在心臟纖維化過程中發揮著重要作用［1］。心力衰竭發展過程中產生大量的促炎因子，這些促炎因子導致心肌細胞肥大和心臟纖維化。因此，抑制心臟炎癥、纖維化有助于改善心力衰竭預后。高良姜素（Galangin，3，5，7-三羥基黃酮）是一種天然來源的黃酮醇類化合物，主要分布于姜科植物高良姜的干燥根莖中。多項研究顯示，高良姜素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤及抗纖維化等作用［2-3］。有研究顯示，高良姜素可減少活性氧生成，抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應及氣道重塑［4］。本研究探討高良姜素通過抗炎、抗氧化、抗纖維化等抑制心臟纖維化發揮抗心力衰竭的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物模型及分組

C57BL/6小鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司［生產許可證：SCK（京）2019-0010］，6～8周齡，雄性，體質量23.5～25.5 g。飼養于無特定病原體（SFP）級環境中，自由攝取食物，晝夜12 h。異丙腎上腺素（ISO）組（6只）小鼠在實驗第1日皮下注射ISO［5 mg/（kg·d）］，共治療14 d，之后每日灌胃對應體積的0.5%羥甲基纖維素溶液，持續4周。高良姜素各劑量組（每組6只）在實驗第1天皮下注射ISO［5 mg/（kg·d）］同時給予不同濃度的高良姜素（重懸于0.5%羥甲基纖維素溶液，每次灌胃前混勻）灌胃，ISO使用14 d，之后持續灌胃高良姜素至4周。正常組（6只）從實驗開始每日灌胃對應體積的0.5%羥甲基纖維素溶液，持續4周。詳見圖1。

1.1.2 實驗試劑與儀器

高良姜素（上海融禾醫藥科技發展有限公司）；ISO（sigma，美國）；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的麥胚芽凝集素（WGA）染色試劑盒（Sigma，美國）；天狼星紅染色試劑盒（北京索萊寶）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成）；過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成）；心臟超聲測量系統（美國GE公司Vivid 7 pro超聲系統）；熒光顯微鏡（Nikon）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）儀（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟超聲心動圖檢查

實驗4周，行心臟彩超檢測小鼠左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD），上述數據測量3次，取平均值，記錄分析。

1.2.2 小鼠體質量、心臟重量及脛骨長度檢測

完成心臟超聲的小鼠，測量體質量（body weight，BW），每只小鼠稱量3次，取平均值并記錄。給予1%戊巴比妥鈉溶液（20 mg/kg）腹腔注射，前胸部開口，暴露心臟，心尖部穿刺，用肝素鹽水灌注5 min，取材。測量心臟重量（heart weight，HW）、脛骨長度（tibial length，TL）。計算心臟重量與體質量比值（HW/BW）、心臟重量與脛骨長度比值（HW/TL）。

1.2.3 組織取材、石蠟切片制備、常規染色

組織取材后，經10%甲醛固定，乙醇脫水、石蠟包埋，垂直于心臟長軸連續切成5 μm的石蠟組織切片，進行WGA染色。采用Nikon顯微鏡收集圖像，并使用Image J軟件進行定量分析。

1.2.4 qPCR檢測

提取小鼠心臟組織總RNA后，將2 μg的RNA按照說明書反轉錄為cDNA。應用SYBR（Servicebio公司），按照說明書檢測相關基因，引物序列如下：膠原蛋白（Collagen）Ⅰ，正向引物5′AAGAAGCACGTCTGGTTTGGAG3′，反向引物5′GGTCCATGTAGGCTACGCTGTT3′；Collagen Ⅲ，正向引物5′TTTCTTCTCACCCTTCTTCATCC3′，反向引物5′CATATTTGACATGGTTCTGGCTTC3′；轉化生長因子-β1（TGF-β1），正向引物5′TAATGGTGGACCGCAACAAC3′，反向引物5′CCACATGTTGCTCCACACTTGAT3′；白細胞介素-1β（IL-1β），正向引物5′TCAAATCTCGCAGCAGCACATC3′，反向引物5′CGTCACACACCAGCAGGTTATC3′；IL-6，正向引物5′CCCCAATTTCCAATGCTCTCC3′；反向引物5′CGCACTAGGTTTGCCGAGTA3′；腫瘤壞死因子-α（TNF-α），正向引物5′CCCTCACACTCACAAACCACC3′，反向引物5′CTTTGAGATCCATGCCGTTG3′；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），正向引物5′CCTCGTCCCGTAGACAAAATG3′，反向引物5′TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT3′。

1.2.5 心臟組織氧化應激水平檢測

取適量心臟組織，按照試劑盒說明書步驟分別進行SOD和CAT活性檢測，同時檢測心臟組織MDA含量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0統計軟件對數據進行分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。統計圖表制作使用GraphPad Prism 9.5軟件完成。

2 結 果

2.1 各組小鼠心臟組織形態學比較

與正常組比較，ISO組小鼠HW/BW、HW/TL升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2。

2.2 各組小鼠心肌細胞橫截面積及心臟纖維化面積比較

WGA染色結果顯示：與正常組比較，ISO組小鼠心肌細胞橫截面積增大（P＜0.05）。天狼星紅染色結果顯示，與正常組比較，ISO組小鼠心臟纖維化程度加重（P＜0.05）；與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟纖維化程度減輕（P＜0.05）。詳見圖3、圖4。

2.3 各組小鼠心功能指標比較

與正常組比較，ISO組小鼠LVEF和LVFS下降，LVEDD、LVESD升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖5。

2.4 各組小鼠心臟Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1 mRNA表達水平比較

與正常組比較，ISO組小鼠心臟纖維化標志物Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟纖維化標志物Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA水平降低，高良姜素中劑量組心臟纖維化標志物TGF-β1 mRNA表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖6。

2.5 各組小鼠心臟組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平比較

與正常組比較，ISO組心臟炎癥標志物IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平升高（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟炎癥標志物IL-6 mRNA降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖7。

2.6 各組小鼠心臟組織氧化應激指標SOD、MDA、CAT水平比較

與正常組比較，ISO組小鼠心臟組織SOD、CAT活性降低，心臟組織MDA含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組SOD活性升高，MDA含量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖8。

3 討 論

心室重塑是心力衰竭發生發展中的重要病理過程，心肌細胞在持續壓力超負荷、缺血、缺氧、炎癥等應激條件下發生結構和功能改變，包括左心室形態改變、心肌細胞肥大和間質纖維化、心肌細胞凋亡［5］。心肌損傷的早期階段，大量的炎癥細胞浸潤到心肌損傷區域并發揮作用。促炎信號通路是由多種促炎細胞因子（如TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6）介導的，可誘導心肌細胞肥大和凋亡，進一步加重炎癥和纖維化，最終導致心室重塑［6］。

氧化應激損傷在心臟纖維化過程中發揮著關鍵作用。病理情況下，活性氧過量積累導致脂質過氧化反應發生，促使細胞損傷和死亡，引起細胞功能障礙［7］。活性氧分子經抗氧化酶如CAT和SOD降解為無毒分子。抗氧化防御機制（SOD、CAT）或內源性抗氧化劑（維生素E、抗壞血酸和谷胱甘肽）濃度降低可增加活性氧水平。有研究顯示，心力衰竭病人血漿和心包積液中脂質過氧化物水平升高，與病人嚴重程度呈正相關［7］。活性氧引發心臟成纖維細胞增殖，激活核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB），以此增加基質金屬蛋白酶表達，導致細胞外基質聚集，促進心肌纖維化［8］。相關研究表明，竹葉提取物通過緩解氧化應激損傷，減輕糖尿病誘導的心臟纖維化［9］。

有研究顯示，順鉑誘導的小鼠腎損傷過程中，高良姜素通過抗炎、抗氧化應激及抗凋亡作用發揮腎臟保護作用［10］；在鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠中，高良姜素通過改善肝臟的抗氧化應激水平，維持高血糖大鼠肝臟的線粒體功能［11］；高良姜素通過抑制炎性因子表達，減輕尿酸誘導的腎臟炎癥反應［12］。

本研究結果顯示，在ISO誘導的心臟損傷及纖維化模型中，高良姜素干預后降低了HW/BW、HW/TL，減輕了心肌間質纖維化程度，縮小了心肌細胞的橫截面積，改善了心功能；高良姜素干預后下調了心臟炎癥標志物（IL-6、IL-1β、TNF-α）和心臟纖維化標志物（Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1）mRNA表達水平，同時升高了心臟組織中抗氧化酶SOD、CAT活性，降低了心臟組織中脂質氧化物MDA的含量。

綜上所述，高良姜素通過減輕心臟炎癥反應、心臟氧化應激反應，抑制心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，從而減輕ISO誘導的心臟損傷及纖維化。但具體分子機制尚未明確，在今后的研究中將深入探討。

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（收稿日期：2023-03-17）

（本文編輯薛妮）