電針通過調節Notch3信號通路改善大腦中動脈閉塞小鼠海馬神經元凋亡的作用機制

摘要 目的：探討電針通過調節Notch3信號通路改善大腦中動脈閉塞小鼠海馬神經元凋亡的作用機制。方法：將45只健康無特定病原體（SPF）級雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組、大腦中動脈閉塞模型（MCAO）組和電針治療組，各15只。通過2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色和小鼠神經行為評分比較小鼠腦梗死神經損傷情況。采用免疫組織化學分析小鼠海馬神經元Bax和Caspase-3蛋白表達。通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）熒光染色分析小鼠神經元細胞凋亡率；通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）分析小鼠海馬組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達；通過免疫組織化學分析小鼠海馬神經元細胞凋亡；通過蛋白印跡分析小鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3及H19/EZH2/Notch3蛋白表達。通過免疫熒光染色分析小鼠脊髓組織Nestin和神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達。結果：連續干預14 d后，MCAO組小鼠神經損傷和腦梗死體積較對照組增加（P＜0.05），電針治療組小鼠神經損傷和腦梗死體積較MCAO組減小（P＜0.05）。MCAO組神經細胞凋亡率較對照組升高（P＜0.05），電針治療組神經元細胞凋亡率較MCAO組減少（P＜0.05）；MCAO組TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS mRNA表達較對照組升高（P＜0.05），電針治療組TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS mRNA表達較MCAO組降低（P＜0.05）。MCAO組Bax和Caspase-3蛋白表達較對照組升高（P＜0.05），電針治療組Bax和Caspase-3蛋白表達較MCAO組降低（P＜0.05），MCAO組Bcl-2蛋白表達較對照組降低（P＜0.05），電針治療組Bcl-2蛋白表達較MCAO組升高（P＜0.05）。MCAO組H19、EZH2和Notch3蛋白表達較對照組升高（P＜0.05），電針治療組H19、EZH2和Notch3蛋白表達較MCAO組降低（P＜0.05）。MCAO組Nestin蛋白表達較對照組降低（P＜0.05），GFAP蛋白表達較對照組升高（P＜0.05）；電針治療組Nestin蛋白表達較MCAO組升高（P＜0.05），GFAP蛋白表達較MCAO組降低（P＜0.05）。結論：MCAO可誘導海馬神經元凋亡，電針通過調控Notch3激活，調節Bax/Bcl-2及Nestin和GFAP蛋白，從而阻斷Caspase-3激活，抑制神經元凋亡。

關鍵詞 大腦中動脈閉塞；Notch3信號通路；電針；海馬神經元；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.24.010

基金項目 湖北省衛生健康委中醫藥科研項目（No.ZY2021M006）

作者單位 十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院（湖北十堰" 442000）

通訊作者 穆敬平，E-mail：568406173@qq.com

引用信息 楊語晗，許明軍，穆敬平.電針通過調節Notch3信號通路改善大腦中動脈閉塞小鼠海馬神經元凋亡的作用機制［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2023，21（24）：4530-4535.

腦卒中是全球第二大死亡原因和第三大殘疾原因［1-2］。據估計，到2030年，中風每年將導致1 200萬例病人死亡，缺血性腦卒中主要由大腦中動脈腦血流阻塞引起，約占所有腦卒中的87.9%，導致嚴重的中樞神經系統損傷甚至死亡［3-4］。缺血性腦卒中是世界范圍內死亡和殘疾的主要原因［5-6］。缺血性腦卒中后血腦屏障受損導致損傷進一步發展和擴大。由于缺血通過剝奪氧氣和代謝底物擾亂腦組織，因此在缺血條件下細胞分泌有害信號［7-9］。這些有害分子促進小膠質細胞活化，通過釋放促炎調節劑［包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6］引起促炎反應，從而導致炎癥誘導的壞死性神經元細胞死亡。神經元壞百會穴死和神經元與小膠質細胞的破壞進一步增強炎癥反應。壞死性凋亡是一種受調節的細胞死亡形式，對缺血性腦卒中損傷的進展有影響。抑制壞死性凋亡可顯著減小梗死面積，抑制炎癥，減輕運動能力，并最終改善腦缺血性損傷后認知功能。Notch信號通路是一種進化上相對保守的信號通路，參與海馬神經元細胞遷移、分化和凋亡。Notch信號通路在一些人類疾病中被激活，包括動脈粥樣硬化、結腸直腸癌和缺血性腦卒中。有研究顯示，抑制Notch信號通路可能通過誘導神經元干分化并減少神經炎癥和神經元凋亡［10］。針灸長期用于疾病預防，一項研究支持其在動物模型中誘導腦缺血耐受作用的證據［11］，結果顯示，在腦缺血前于百會穴（GV20）進行電針可減輕動物模型中缺血后神經功能缺損程度。目前，已從抑制炎癥、抑制氧化應激、抑制內質網應激、調節大麻素系統、自噬、保護血腦屏障、抗凋亡等多方面探討了電針預處理誘導腦缺血耐受的機制。多項研究表明，電針可抑制神經元凋亡，改善神經元微環境，加速水腫減輕和神經功能修復；抑制促炎細胞因子和Notch信號通路相關因子的表達，表明抑制電針誘導的Notch信號通路有助于緩解缺血性腦卒中［12-13］。本研究旨在探討電針通過調節Notch3信號通路改善大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠海馬神經元凋亡的機制，為腦梗死等腦血管疾病類型提供新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45只健康無特定病原體（SPF）級雄性C57BL/6小鼠，體質量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司。小鼠生存溫度（23.0±2.0）℃，環境濕度45%～50%，光照時間每日12 h；適應期間可隨意獲取水和適應性飼料。

1.1.1 小鼠MCAO模型的建立

MCAO模型采用改良的Zea Longa方法建立。腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg后，將小鼠仰臥固定于37 ℃恒溫電加熱板上經頸正中切口分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎頸總動脈近端。使用無創血管夾住頸總動脈遠端和頸外動脈。在頸總動脈分叉處做一切口，放置頭部鈍化的尼龍線。將尼龍線緩慢向前推8～10 mm。當感覺到阻力時，停止并固定在頸總動脈上。栓塞1 h后，拔出線塞恢復血流。再灌注2 h后，使用神經功能評分驗證模型是否成功。

1.1.2 動物分組

將45只小鼠隨機分為3組，每組15只，對照組除不將細絲推進至大腦中動脈起點處外，其他處理與MCAO組相同；MCAO組建立小鼠MCAO模型；電針治療組：MCAO小鼠模型建立后，百會穴位于矢狀中線與兩耳連線的交點處，使用XYD-IV儀器（翔宇醫療，型號20152260115），以1 mA的強度和2～15 Hz的頻率刺激，每日20 min，連續14 d。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠神經損傷評估

神經行為評分包括6方面：自發活動（籠中5 min，0～3分）、運動對稱性（四肢，0～3分）、前肢對稱性（尾握時伸展，0～3分）、鐵絲籠爬墻（1～3分）、軀干兩側的觸摸反應（1～3分）和觸須觸摸的反應（1～3分）。總分18分，得分越低提示神經功能受損程度越小，計算腦梗死體積。

1.2.2 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色計算腦梗死體積

將小鼠麻醉并處死后提取腦組織，使用冰鹽水沖洗后，在－20 ℃冰箱中快速冷凍腦組織20 min，使腦組織變硬進行切割。沿冠狀面切片，厚度為2 mm，每個腦切5片或6片。將腦切片放入用錫紙包裹并置于含有2%TTC（北京索萊寶公司）的培養皿中，在37 ℃培養箱中染色30 min。在此期間，輕輕轉動大腦切片，使其充分暴露于反應液中。取出培養皿，用1 mL針管吸出TTC溶液，將切片置于4%多聚甲醛溶液中固定5 min，取出切片按順序擺放。采用Image-Pro Plus圖像軟件計算每個腦切片的腦梗死體積比。為減少腦缺血性半球水腫引起的誤差，梗死體積為對側正常腦組織體積－同側正常組織體積，結果以梗死體積百分比表示：梗死面積體積百分比＝（對側正常腦組織體積－同側正常腦組織體積）/對側正常組織體積×100%。

1.2.3 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）熒光染色檢測細胞凋亡率

小鼠腦組織經二甲苯脫蠟、乙醇脫水后，石蠟切片加入20 μg/mL蛋白酶K工作液（北京索萊寶公司），室溫放置15" min。向每個樣品中加入51" μL的TUNEL溶液（45" μL平衡緩沖液∶5" μL核苷酸混合物∶1" μL rTdT酶），避光孵育1" h。加入2×SSC緩沖液在室溫下孵育15 min以終止反應。加入含有抗熒光淬滅的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），黑暗中孵育 5 min，蓋上蓋玻片。通過熒光顯微鏡（倒置熒光顯微鏡，德國）獲得海馬CA1區圖像（200倍）。計算不同視野內凋亡陽性細胞百分比，取平均值進行統計分析。凋亡率＝陽性細胞/細胞總量×100%。

1.2.4 免疫組織化學分析小鼠海馬神經元細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達

組織包埋，切片，烘烤，脫蠟，補液和抗原修復后，在37 ℃條件下，將細胞在2%的低聚甲醛中固定4 h，在封閉緩沖液［含10%山羊血清和0.01% Tween-20的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）］中孵育1 h。37 ℃條件下，在封閉緩沖液中將組織與第一抗體［兔鼠抗小鼠Bcl-2多克隆抗體（1∶200）、兔鼠抗小鼠Bax多克隆抗體（1∶200）、兔抗小鼠Caspase-3多克隆抗體（1∶200）］4 ℃過夜。將組織用含0.05%Tween-20的PBS洗滌3次，在室溫下添加1∶200的山羊抗小鼠二抗（Aspen公司），在37 ℃條件下，細胞孵育4 h。使用PBS洗滌切片3次，加入顯色劑（DAB）。最后，將切片沖洗，DAPI復染密封。在Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡下觀察，使用Zen 2.31 SP（黑色版）軟件（Zeiss）處理圖像。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達

收集小鼠的海馬組織，在1 mL TRIzolReagent（15596026，賽默飛世爾科技公司，美國）中研磨成組織勻漿，轉移到 1.5 mL離心管中，加入200 μL氯仿，混合并在4 ℃、10 000 r/min下離心5 min以獲得總 mRNA（在上層水相中）。加入500 μL異丙醇，混勻，在相同條件下再次離心，純化mRNA。棄上清，采用75%乙醇洗滌異丙醇，得到離心管底部富集的mRNA沉淀。加入50 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解mRNA，用Nano Drop微管分光光度計（Invitrogen公司，美國）測量mRNA濃度。根據試劑盒說明，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（04897030001，羅氏公司，德國）將mRNA逆轉錄為cDNA。通過實時PCR系統（LightCycler480，羅氏公司，德國）檢測每個樣品TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS mRNA表達水平。

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測海馬H19、EZH2和Notch3蛋白表達水平

1）提取蛋白：人卵巢癌細胞，加入10 mL/mg蛋白免疫印跡法及IP細胞裂解液，使用勻漿器勻漿，利用超聲組織破碎儀破碎細胞（破碎條件為每管4次/300 W），細胞破碎后冰上放置30 min，將破碎后的細胞進行離心，4 ℃、12 000×g（重力加速度）離心30 min，收集上清液，即為蛋白抽提液。2）蛋白定量：使用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，將蛋白濃度調節一致。 3）凝膠電泳：取待測標本15 μL進行上樣，該過程中選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單抗（1∶500）作為蛋白質上樣量的標定物，每泳道上樣30 μg蛋白量。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroresis，SDS-PAGE）進行電泳分析，至目的分子量出現。4）濕法轉膜：采用濕法將蛋白條帶電轉至Immun-blot 聚偏乙烯膜（PVDF）上，加入濃度為50 g/L的脫脂奶粉在20 ℃條件下封閉震蕩處理3 h，加入以下抗體［兔鼠抗小鼠H19多克隆抗體（1∶400）、兔抗小鼠EZH2（1∶400）多克隆抗體、兔抗小鼠Notch3多克隆抗體（1∶400）］，4 ℃孵育過夜，用TBS緩沖液（Tris 50 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，pH7.5）沖洗3次，每次10 min。使用經過辣根酶標記的IgG（1∶1 000），在37 ℃條件下孵育2 h，漂洗3次，每次10 min。5）發光顯影：使用電化學發光（ECL）試劑盒進行顯影操作。首先等體積混合ECL試劑盒中的A液和B液，20 ℃保存備用，將二抗加入于反應液中進行孵育，使用PBS進行多次洗滌，取出膜后使用潔凈的吸水紙輕輕吸去多余的液體，將膜放置在潔凈的保鮮膜上，整個操作過程需要謹慎小心，避免觸碰蛋白電泳一側。按照0.125 mL/cm2滴加發光液，使發光液均勻覆蓋在膜上靜置5 min，取出膜，去除上面的發光液。將膜固定在兩片保鮮膜中間，于暗室內壓片5 min后完成顯影定影操作。選擇GAPDH單抗（1∶1 000）作為內參。6）圖像分析：膠片干燥后，使用Mieroteck掃描儀掃描圖像，利用Quantity-One軟件進行積分光密度分析。

1.2.7 免疫熒光染色法檢測MCAO和電針治療小鼠脊髓組織中Nestin和神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達

取10 μm厚的脊髓組織切片在4 ℃下在4%多聚甲醛中固定。將脊髓組織與封閉溶液（0.2% Triton X-100）和5%牛血清白蛋白（V/V）在室溫下孵育1 h，在4 ℃下與相應的溶液孵育過夜。針對膠質纖維酸性蛋白（GFAP 1∶1 000，Abcam公司，美國）和巢蛋白（1∶200，Abcam公司，美國）的特異性抗體，沖洗后，將切片與Alexa Fluor 555（1∶500；Abcam公司，美國）抗兔IgG作用1 h。用4′，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）復染細胞核。采用Nikon Eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司，日本）捕獲熒光圖像。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件（美國IBM公司）對數據進行分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD-t）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠腦神經損傷得分和腦梗死體積比較

MCAO組小鼠神經損傷和腦梗死體積較對照組增加（P＜0.05），電針治療組小鼠神經損傷和腦梗死體積較MCAO組減少（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組小鼠神經細胞凋亡率比較

MCAO組神經細胞凋亡率較對照組升高（P＜0.05），電針治療組神經細胞凋亡率較MCAO組降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 各組炎性因子mRNA表達比較

MCAO組TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS mRNA表達較對照組升高（P＜0.05），電針治療組TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS mRNA表達較MCAO組降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 電針治療抑制MCAO小鼠海馬神經元細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達

通過免疫組織化學分析小鼠海馬神經元細胞凋亡，MCAO組Bax和Caspase-3蛋白表達較對照組升高（P＜0.05），電針治療組Bax和Caspase-3蛋白表達較MCAO組降低（P＜0.05）；MCAO組Bcl-2蛋白表達較對照組降低（P＜0.05），電針治療組Bcl-2蛋白表達較MCAO組升高（P＜0.05）。詳見圖1、表4。

2.5 電針治療對H19/EZH2/Notch3信號通路的影響

MCAO組H19、EZH2和Notch3蛋白表達較對照組升高（P＜0.05），電針治療組H19、EZH2和Notch3蛋白表達較MCAO組降低（P＜0.05）。詳見表5、圖2。

2.6 電針治療對脊髓組織中神經干細胞Nestin和GFAP蛋白表達的影響

MCAO組Nestin蛋白表達較對照組降低（P＜0.05），GFAP蛋白表達較對照組升高（P＜0.05）；電針治療組Nestin蛋白表達較MCAO組升高（P＜0.05），GFAP蛋白表達較MCAO組降低（P＜0.05）。免疫熒光染色檢測MCAO和電針治療小鼠脊髓組織中Nestin和GFAP蛋白表達，紅色代表GFAP陽性，綠色代表Nestin陽性，免疫熒光染色結果顯示，與MCAO組比較，電針治療組Nestin蛋白水平增加，GFAP蛋白水平降低。表明電針治療顯著增加神經元干細胞增殖并抑制向星形膠質細胞分化。詳見圖3、表6。

3 討 論

腦血管病是一種臨床的常見疾病，具有高發病率、高死亡率、高致殘率和高復發率的特點［14-15］。腦梗死約占腦血管疾病的70%以上，是一類影響大、預后差、治療選擇有限的腦血管疾病［16-17］。針灸治療阿爾茨海默病、中風、缺血性腦卒中痙攣性偏癱可發揮良好的治療作用，但作用機制尚未明確［18-19］。因此，電針治療腦梗死的作用機制是目前的研究熱點。本研究證實電針刺激對腦梗死小鼠具有保護作用，可改善MCAO小鼠神經功能損傷，減小腦梗死體積，降低小鼠炎性細胞因子水平等。細胞凋亡是神經系統缺氧缺血性神經元丟失的重要原因。本研究通過TUNEL熒光染色分析發現，電針降低了MCAO小鼠海馬神經元凋亡率；蛋白印跡分析發現電針治療降低MCAO小鼠凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達，促進Bcl-2升高，并抑制MCAO引起的炎性因子水平升高。

有研究表明，電針可保護或預防MCAO早期和中期功能性神經元死亡，抑制Notch信號通路［20］。MCAO后是急性但持久的炎癥反應，特點是活性氧產生增加。載脂蛋白E（ApoE）在MCAO中具有抗炎、抗氧化和抗凋亡特性，電針通過增加ApoE表達，減輕MCAO炎癥和氧化應激反應。電針刺激在MCAO后發揮神經保護作用，與腦源性神經營養因子和神經營養因子上調相關。電針可抑制疼痛信號的誘導和傳遞，通過重新平衡神經-免疫-內分泌相互作用，介導抗傷害和抗炎作用。腦梗死可觸發多種細胞信號通路，導致細胞存活或細胞損傷。電針通過調節腦梗死大鼠模型中的p38、細胞外信號調節激酶（ERK1/2）和c-Jun N末端激酶（JNK）抑制腦梗死區域的細胞凋亡。本研究結果顯示，MCAO組小鼠Notch3信號通路相關基因表達顯著增加；電針通過Notch3信號通路抑制腦梗死海馬神經元凋亡，Notch3通路在電針治療腦梗死中起關鍵作用。EZH2增強子是一種組蛋白甲基轉移酶，在細胞分化、炎癥、肌成纖維細胞轉化和組織纖維化中發揮著重要作用。EZH2在人類膽管癌和系統性硬化癥中充當了Notch信號通路的調節劑。分子量為2.3 kDa的長鏈非編碼RNA（lncRNA）H19在MCAO、糖尿病和類風濕性關節炎中高表達，通過調節let-7b、Wnt和Notch信號通路促進神經元細胞凋亡。H19可調節異常細胞和組織中的 EZH2表達，表明其與EZH2參與MCAO的進展。EZH2在細胞增殖和凋亡中發揮著關鍵作用。在毛囊干細胞中，EZH2通過抑制miR-22，促進細胞增殖和分化，激活信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3），增加細胞凋亡和促炎細胞因子的釋放。H19與miR-138的相互作用可調節EZH2表達。本研究結果表明，H19通過激活Notch3信號通路在提高因子基因表達方面發揮作用，EZH2和H19表達與Notch3信號通路的激活有關。相關研究顯示，2、50 Hz的電針刺激在運動性能方面表現出持續且顯著的增強［21］。本研究結果顯示，2 Hz的電針刺激可促進神經干細胞增殖，抑制Notch3信號通路，促進神經干細胞增殖，即抑制Notch3信號通路可作為保護MCAO的神經元凋亡的靶點。

綜上所述，MCAO可誘導海馬神經元凋亡，電針通過調控Notch3激活，調節Bax/Bcl-2及Nestin和GFAP蛋白，從而阻斷Caspase-3激活抑制神經元凋亡，該結果可為腦梗死的治療提供實驗依據。

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（收稿日期：2022-06-21）

（本文編輯薛妮）