新建輔助生殖實驗室體外受精胚胎培養技術的小鼠實驗評價

桂俊豪 楊楠 常艷艷 蘇雪梅

體外受精(In vitro Fertilization,IVF)和胚胎移植(Embryo Transfer,ET)是臨床上治療不孕癥的重要技術手段。在人類輔助生殖技術(ART)實踐中,胚胎培養室是人類配子操作和胚胎培育的核心功能區,受多種復雜因素影響,其中胚胎培養環境的氣體質量、培養體系的可靠性及穩定性、人工操作質控水平等至關重要,事關配子機能穩定性及相互作用、胚胎發育質量和IVF-ET周期的治療結局[1-2]。既往研究表明,鼠胚實驗(Mouse Embryo Assay,MEA)[3]是綜合性評價胚胎培養室合格與否的有效方法。本文通過MEA對本院生殖醫學中心新建胚胎培養室的培養體系和操作穩定性進行了臨床前評估,現報告如下。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物:雌性昆明鼠(4～6周齡,體重25～35 g)、雄性昆明鼠(8周齡以上,體重40～50 g)購自新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心,飼養溫度21～25 ℃,水、飼料供應充足。每批雌鼠均在計劃實驗前20 d開始飼養。

2.試劑耗材:獸用PMSG和HCG(1 000 IU粉劑/支)均購自寧波三生藥業,HCG用0.9%生理鹽水5mL稀釋為200 IU/mL的濃儲液儲存,PMSG用5 mL PMSG稀釋液稀釋成200 IU/mL的濃儲液,-20℃保存備用。G-MOPS PLUS、G-IVF PLUS、G-1 PLUS、G-2 PLUS和石蠟油均為Vitrolife公司產品。3001皿、四孔皿、1 mL移液管、10 mL移液管均購自FALCON公司;高純度氮氣(99.999%)、高純二氧化碳氣(99.999%)購自大連大特氣體有限公司。

3.主要儀器設備:Stemi 508 體視顯微鏡購自德國卡爾蔡司公司;G-185三氣培養箱、C-60二氧化碳培養箱分別購自丹麥K-system公司和德國Labtech公司;ECLIPSETi倒置顯微鏡為日本尼康公司產品;Sterile180工作站購自丹麥IVFtech公司。

二、實驗方法

1.實驗分組:按照受精方式不同,采用配對隨機化設計,將促排雌鼠隨機分為體內受精組和體外受精組,共7批次兩組各20個周期。以其中一個批次的配對隨機化為例,首先將20只雌鼠編為1～20號后稱重,同體重或體重非常接近的兩只雌鼠配成一個對子,共配成10對并依次編為A～J,然后從“隨機數字表”的任何一頁、任何一處開始,以一定方向抄下10個數字并依次排在配對號下,分組時,凡隨機數字為單數者,該對子中的第一只雌鼠分入甲組,而同對子中的另一只雌鼠歸入乙組,若隨機數字為雙數,就把該對子中的第一只雌鼠分入乙組,而同對子中的另一只雌鼠則歸入甲組。

體內受精組與雄性小白鼠交配,D1獲取體內受精胚胎進行體外培養;體外受精組直接獲取卵母細胞,通過體外受精后進行體外培養。

2.體外受精:(1)促排卵和鼠卵采集。體外受精組雌性小鼠于18:00進行腹腔注射PMSG 10 IU,48 h后腹腔注射HCG 10 IU。16～18 h后頸椎脫臼法處死雌鼠,在無菌條件下取出膨大的輸卵管,放入盛有G-MOPS PLUS的培養皿中,用一次性1 mL注射器刺破輸卵管膨大部,將卵母細胞團收集到G-IVF PLUS受精皿中,放入37 ℃,5% CO2,90%濕度的培養箱。(2)鼠精采集和獲能。頸椎脫臼法處死雄鼠并開腹,在無菌條件下分離附睪尾放入G-IVF PLUS受精液中,用一次性1 mL注射器小心刺破輸精管,輕輕擠壓出精子,收集精子懸浮液,放入37℃、6% CO2、飽和濕度的培養箱中獲能30～60 min。(3)體外受精及胚胎觀察。采用四孔皿集中受精法。記錄獲卵數,將所獲鼠卵分配至四孔皿中,每孔10～20個卵不等;吸取獲能精子懸液到含有卵子的培養液中,放入37 ℃、6% CO2、飽和濕度的培養箱中孵育。受精后20 h觀察2-細胞,30～40 h 觀察4-細胞,60～70 h觀察8-細胞及桑葚胚,90 h后觀察囊胚。

3.體內受精:同日下午18:00,將體內受精組注射HCG后的雌鼠與雄鼠按1:1比例合籠,次日早晨觀察雌鼠的陰道栓形成情況。將有陰道栓的雌鼠處死,獲取卵子。獲取2-細胞方法同體外受精組。

4.統計學分析:計錄卵裂數和囊胚形成數,其中如受精卵分裂成為2-細胞胚胎即認為卵裂,分別計算2-細胞卵裂率(即2-細胞數/獲卵數)和囊胚形成率(即囊胚形成數/2-細胞數)。應用SPSS 19.0對實驗數據行統計學分析,χ2檢驗用于率的比較;P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、鼠胚發育的形態學觀察(×100)

促排后獲得小鼠卵母細胞團見圖1A,圖1B至圖1F依次為受精卵(圖1B)、2-細胞鼠胚(圖1C)、4-細胞和8-細胞鼠胚(圖1D)、桑葚胚(圖1E)和囊胚(圖1F)。

圖1 小鼠卵母細胞體外受精后的胚胎發育(×100)Fig 1 Embryo development ofin vitro fertilized mouse oocytes(×100)

二、卵裂率和囊胚形成率

體內受精組和體外受精組分別開展了7批次各20 個周期的胚胎培養。IVF 周期共獲卵805 枚,結果見表1,其中 2-細胞胚胎數720 枚,卵裂率為89.4%,形成囊胚656 個,囊胚形成率為90.3%(表1)。

表1 昆明小鼠體外受精(IVF)實驗結果Table 1 Data analysis of in vitro fertilization experiments in Kunming breed mice

體內受精組共獲卵752 枚,其中 2-細胞胚胎數708個,卵裂率為94.1%,形成囊胚652 個,囊胚形成率為92.1%(表2)。

表2 昆明小鼠體內受精體外培養實驗結果Tab 2 Data analysis of in vivo fertilization experiments of Kunming breed mice

體內受精和IVF 周期的比較見表3,體內受精組卵裂率顯著高于體外受精組(P<0.05),而兩組間囊胚形成率無顯著差異。

表3 體外受精組和體內受精組的結果比較Tab 3 Comparison betweenin vitro and in vivo fertilization groups

討 論

在新裝修的胚胎培養室內部環境下開展鼠胚實驗(MEA),建立合理化配子及胚胎操作流程,考察新建胚胎培養室環境可靠穩定性和人員配子及胚胎操作熟練程度,為新建胚胎培養室的臨床前應用提供保證[4-8]。鼠胚實驗關鍵環節主要涉及雌鼠控制性促排卵、鼠卵體外受精和受精卵體外培養,期間所涉及的胚胎培養室環境質量、設備、材料、試劑和方法等步驟與開展人類輔助生殖技術流程和要求具有通用性,因此,鼠胚實驗中受精鼠卵的卵裂率、囊胚形成率等是綜合判斷新建胚胎培養室環境、材料質量和人員基本技術水平的主要常用指標。

本研究采用體內受精和體外受精方法,共開展了7個批次、兩組各20個周期的鼠胚實驗,體內受精和IVF組分別獲得受精卵752和805個,體內、體外兩組的總體卵裂率分別為94.1%和89.4%,體內受精組的卵裂率明顯高于體外受精組,可能與每批次小鼠個體差異、對環境適應性不同以及對促排卵藥物的反應性差異有關,體外受精組略低于體內受精組,也可能受胚胎體外操作期間環境應激影響。數據表明,體外受精組的卵裂率介于85.3%～94.1%之間、囊胚形成率介于87.7%～92.7%之間,體內受精組的卵裂率和囊胚形成率分別介于91.4%～100%之間和88.6%～100%之間,總體上均高于85%的要求。體內、體外兩組實驗的整體囊胚形成率分別為92.1%和90.3%,組間未見統計學差異。上述結果說明,本新建實驗室的體外受精胚胎培養體系及人員操作技術水平達標常規開展ART的基本需求。