基于GABA信號通路探究柏子養心湯對失眠大鼠睡眠時相的影響

譚高峰,喬明亮,郭 健,鄭偉鋒,趙彥青,張希倩

0 引言

1 材料和方法

1.1 動物 124只健康雄性SPF級6～7周齡Sprague Dawley(SD)大鼠,體重(200±20) g,由河南省實驗動物中心提供,許可證號：SCXK(豫)2017-0001。所有大鼠在河南省中醫院中心實驗室飼養,許可證號：SYXK(豫)2021-0018,于12 h光暗循環、溫度20～22 ℃和濕度50%～55%的房間中飼養,喂食期間大鼠可自由飲水。本實驗經河南省中醫院動物倫理委員會審批(批號：HNZYY20210819)。

1.2 主要藥品、試劑及儀器 柏子養心湯：柏子仁10 g,遠志10 g,酸棗仁20 g,黨參20 g,枸杞子15 g,黃芪20 g,當歸10 g,白芍10 g,五味子10 g;飲片購自河南省中醫院,常規方法煎煮,雙層棉紗布進行過濾,收集濾液并文火煎煮濃縮制成2 g生藥/ml的水提物,分裝后4 ℃冰箱內保存備用。對氯苯丙氨酸(Para-chlorophenylalanine,PCPA)(C6506)購自美國Sigma公司;大鼠GABA檢測試劑盒(FS-E6774)購自上海撫生實業有限公司;大鼠Glu檢測試劑盒(AKAM002U)購自北京盒子生工科技有限公司;兔源一抗谷氨酸脫羧酶67(Glutamate decarboxylase 67,GAD67)(ab213508)、γ-氨基丁酸A型(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABAA)受體α1(GABRA1,ab252430)、GABAA受體β2(GABRB2,ab156000)、GABAA受體γ2(GABRG2,ab288564)均購自英國Abcam公司。71000全自動腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);SleepSign動物睡眠生物解析系統(日本KisseiComtec公司);Multiskan GO酶標儀(Thermo Scientific,美國);BX61光學顯微鏡(日本Olympus公司);ABI Prism 7500型實時熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 腦電圖(Electroencephalogram,EEG)和肌電圖(Electromyogram,EMG)電極埋置 用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠并固定在腦立體定位儀中,暴露頭骨。參照文獻報道的方法[13]將2個螺釘電極(直徑1 mm)植入顱骨(AP-2,R2;AP+2,R2)作為皮層電極,另一個置于額骨中心(AP+5,R0)作為皮層電極接地電極。皮層電極必須接觸硬腦膜,但不穿破硬腦膜。電極通過引線連接到微型插座上,并用牙科丙烯酸水泥固定在頭骨上。將2根采集EMG的電極分別插入兩側頸部斜方肌中[14]。術后,將大鼠放入單獨的有機玻璃盒中,并在標準條件下飼養在電磁屏蔽記錄室中。每只大鼠腹腔注射45 000 U青霉素3 d預防感染,每天1次。恢復7 d后,測試前,將附有EEG記錄導線的插頭連接到大鼠頭部電極插座5.5 h以適應實驗條件。

1.3.2 模型的建立 PCPA混懸液配置：NaHCO3片劑用30～40 ℃的溫水溶解,調配成濃度為5%的NaHCO3溶液,在一定量生理鹽水中緩慢滴加配置好的NaHCO3溶液,在滴入過程中用pH精密試紙測試,將pH值調至7～8之間。然后加入PCPA,攪拌后加阿拉伯膠,再用超聲處理15 min即可。將SD大鼠隨機分為對照組(n=24)和造模組(n=100),參考文獻方法[15]建立失眠大鼠模型：將PCPA用生理鹽水溶解,造模組大鼠于每日上午8至9點以300 mg/kg的劑量腹腔注射PCPA溶液,注射體積為10 ml/kg,每天1次,連續注射2 d。對照組注射等量生理鹽水。第2次注射PCPA后12 h,觀察造模組大鼠的狀態,并將對照組和造模組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50 mg/ml)進行戊巴比妥鈉翻正實驗,記錄大鼠睡眠潛伏期和睡眠時間。若大鼠出現躁動不安,晝夜節律紊亂,對外界聲、光等刺激敏感性增加,且戊巴比妥鈉翻正實驗中,與對照組相比,造模組大鼠的睡眠時間縮短、睡眠潛伏期延長(P<0.05),提示造模成功。實驗共造模100只大鼠,有96只大鼠成功建立失眠模型。

1.3.3 分組與給藥 將96只失眠大鼠隨機分為模型組及柏子養心湯低、中、高劑量組,每組24只。柏子養心湯組大鼠分別給予5.625 g/kg、11.25 g/kg、22.5 g/kg的柏子養心湯灌胃,對照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃,每天1次,連續7 d。柏子養心湯劑量換算：根據人和動物的體表面積計算藥物的等效劑量(大鼠日劑量約為成人的6.3倍)。成人體重以70 kg計算,柏子養心湯成人每日給藥劑量相當于生藥125 g,則大鼠每日給藥劑量為125 g/70 kg×6.3=11.25 g/kg。因此,設置藥物低、中、高劑量為5.625 g/kg、11.25 g/kg、22.5 g/kg。

1.3.4 大鼠一般活動狀態 觀察各組大鼠的精神狀態、毛發光澤和晝夜節律變化以及活動情況,給藥結束后稱量體重。

1.3.5 大鼠睡眠時相分析 末次給藥后2 h,將大鼠置于安靜的實驗室,連接動物睡眠生物解析系統,從第1天19∶00開始,到次日19∶00結束,連續記錄自由活動大鼠的EEG和EMG,分析睡眠覺醒(Wake)時間、非快速眼動(Non-rapid eye movement,NREM)睡眠時間和快速眼動(Rapid eye movement,REM)睡眠時間,觀察大鼠睡眠時相變化。睡眠Wake以8 Hz以上α和β波為主,伴有明顯的EMG信號;NREM睡眠以0.5～4 Hz δ波為主,EMG信號不明顯;REM睡眠以4～8 Hz θ波為主,EMG信號基本沒有[14]。根據判定結果,統計夜晚(19∶00～次日7∶00)和白天(次日7∶00～19∶00)大鼠Wake總量和NREM、REM睡眠總量。

1.3.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠下丘腦5-HT、Glu與GABA含量 每組隨機選取6只大鼠,取出全腦后分離下丘腦(將大鼠腦組織翻轉后可見2個對應的菱形突起,用眼科剪左右各剪2刀,深度約1～2 mm,然后取出即可),濾紙吸干后稱重,稱重后用PBS研磨(按1∶9的重量體積比)制備10%的組織勻漿,在4 ℃下1 000 g離心15 min。收集上清液,采用ELISA試劑盒檢測下丘腦中5-HT、Glu與GABA含量。

1.3.7 免疫組織化學法(IHC)檢測大鼠下丘腦GAD67表達 每組隨機選取6只大鼠的下丘腦,用4%多聚甲醛固定過夜,經梯度乙醇脫水后,用石蠟包埋并連續切5 μm厚的切片。切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,用3%過氧化氫處理10 min,微波法進行抗原修復,正常山羊血清封閉20 min。然后將切片與一抗GAD67(1∶100)在4 ℃下孵育過夜,PBS清洗后,滴加二抗在37 ℃下孵育30 min;DAB顯色、蘇木精復染。最后,二甲苯透明,封片。在光學顯微鏡下觀察GAD67陽性表達(細胞膜和細胞質呈棕黃色染色),每張切片隨機選擇5個視野,計數每個視野中GAD67陽性表達的平均光密度(Average optical density,AOD)值。

1.3.8 Western blot檢測下丘腦GABAA受體亞基(GABRA1、GABRB2和GABRG2)蛋白表達 每組隨機選取6只大鼠,斷頭取腦,分離下丘腦,液氮速凍后,-80 ℃冰箱保存備用。用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液盒提取下丘腦組織中的總蛋白。將等量的總蛋白加到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上,通過電泳分離并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h后,與一抗GABRA1(1∶1 000)、GABRB2(1∶1 000)、GABRG2(1∶1 000)和β-肌動蛋白(β-actin,1∶2 000)在4 ℃下孵育過夜。然后洗滌膜并在室溫下與結合辣根過氧化物酶(HRP)的二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h。最后,使用增強型化學發光(ECL)試劑顯影,Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。β-actin用作內參對照。

1.3.9 RT-qPCR檢測下丘腦組織中GABAA受體亞基(GABRA1、GABRB2和GABRG2)mRNA表達 每組剩余6只大鼠,取下丘腦組織,Trizol試劑提取總RNA,然后用逆轉錄試劑盒合成cDNA。使用Green Premix PCR試劑盒在ABI Prism?7500型RT-qPCR儀上將該cDNA用作擴增的靶標。熱循環方案：95 ℃ 10 min,然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s和72 ℃ 10 s的50個循環。2-ΔΔCt(Ct為循環閾值)方法計算基因表達,并將靶基因的相對表達量標準化為β-actin。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態和體重變化 對照組大鼠精神狀態良好,毛發有光澤,晝夜節律明顯,白天活動較少;與對照組相比,模型組大鼠精神狀態較差,毛發凌亂枯黃、無光澤,晝夜節律消失,白天活動增多,對外界的反應增強,體重顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養心湯低、中、高劑量組大鼠精神和活動狀態明顯改善,毛發有光澤,體重顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見表2。

2.2 各組大鼠睡眠時相變化 與對照組相比,模型組Wake總量顯著增加,NREM和REM睡眠總量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養心湯低、中、高劑量組Wake總量顯著減少,NREM和REM睡眠總量顯著增加(P<0.05),且呈劑量依賴性。見表3。

表2 各組大鼠體重比較

表3 各組大鼠夜晚和白天Wake、NREM和REM睡眠總量比較

2.3 各組大鼠下丘腦中5-HT、Glu與GABA含量 與對照組相比,模型組大鼠下丘腦中Glu含量和Glu/GABA比值顯著升高,5-HT、GABA含量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養心湯低、中、高劑量組Glu含量和Glu/GABA比值顯著降低,5-HT、GABA含量顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見表4。

表4 各組大鼠下丘腦中5-HT、Glu與GABA含量比較

2.4 各組大鼠下丘腦中GAD67表達 與對照組相比,模型組大鼠下丘腦中GAD67陽性表達顯著減少(P<0.05);與模型組相比,柏子養心湯低、中、高劑量組GAD67陽性表達顯著增加(P<0.05),且呈劑量依賴性。見圖1、表5。

圖1 各組大鼠下丘腦中GAD67表達(IHC,200×)

表5 各組大鼠下丘腦中GAD67表達比較

2.5 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白表達 與對照組相比,模型組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養心湯低、中、高劑量組GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白表達

表6 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平比較

2.6 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2 mRNA表達 與對照組相比,模型組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養心湯低、中、高劑量組GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見表7。

表7 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平比較

3 討論

中醫稱失眠為“不寐”、“目不瞑”、“不得眠”、“不得臥”,年老體虛,情志失常,飲食不節,勞逸失度等為其常見病因;病位在心,與肝、脾、腎密切相關[16-17]。柏子養心湯被廣泛應用于失眠的治療[6-7]。柏子養心湯為中醫經典方劑,由柏子仁、酸棗仁、黨參、黃芪、當歸、茯苓、遠志、五味子等中藥組成。方藥中柏子仁、酸棗仁為君藥,有養心安神之效;黨參、黃芪可健脾益氣、溫補元氣、促使陰陽平衡;當歸活血補血;茯苓、遠志能補心安神;五味子補益心腎、寧心安神;諸藥合用共奏補益心腎、調整陰陽、寧心安神的功效,能從根本上調整患者狀態,改善睡眠質量。現代藥理學研究顯示,柏子仁可通過增加GABA水平發揮抗焦慮作用[8];酸棗仁-茯苓-黨參水提物能調節小鼠腦內Glu/GABA穩態,改善失眠小鼠的睡眠質量[10];當歸的活性成分當歸多糖能夠升高GABA水平,調節神經遞質傳導,改善小鼠抑郁行為[11];遠志可升高失眠大鼠下丘腦GABA含量,降低Glu含量,調節中樞神經遞質水平,從而起到安神益智的功效,提高失眠大鼠的學習記憶能力[9];五味子提取物可通過調控海馬組織內GABAARα1、GABAARγ2表達,改善失眠大鼠睡眠和自主活動[12]。基于以上研究,推測柏子養心湯對失眠的改善作用可能與GABA信號通路有關。

為了驗證此推測,本研究通過腹腔注射PCPA,成功建立了失眠大鼠模型。PCPA是一種5-HT合成酶抑制劑,能阻滯腦內5-HT的合成,導致睡眠晝夜節律消失,引發失眠。NREM和REM睡眠是睡眠時相中2個重要階段,這2種類型睡眠的總量決定了睡眠的質量[14]。本研究結果顯示,柏子養心湯可通過增加PCPA導致的失眠大鼠5-HT含量、NREM和REM睡眠總量的減少,延長睡眠時間,提高失眠大鼠的睡眠質量,與既往的研究結果一致,表明柏子養心湯具有改善睡眠的作用。

下丘腦為人體多種生物調節節律中樞,通過與不同的大腦區域進行交流,在睡眠-覺醒調節中發揮著核心作用[18]。GABA、Glu在腦內,特別是下丘腦內含量極高,是睡眠調節中不可或缺的重要因素[19]。GABA是哺乳動物大腦中主要的抑制性神經遞質,與正常人相比,睡眠障礙患者的腦內GABA濃度顯著降低[20]。另一項研究表明,口服GABA 30 min后可達峰濃度,可顯著縮短受試者的睡眠潛伏期并增加NREM睡眠時間[21]。Glu是主要的興奮性神經遞質,GABA是Glu在谷氨酸脫羧酶(GAD)作用下脫羧形成的,因此,Glu/GABA的比值可以用來評價神經系統的興奮或抑制狀態。GAD67是GABA的關鍵合成酶,GAD67蛋白水平的降低可抑制Glu向GABA轉化[22]。本研究檢測了下丘腦中GABA和Glu的含量,結果顯示,PCPA模型大鼠下丘腦內GABA水平降低,Glu/GABA比值升高,表明神經系統處于興奮狀態,而柏子養心湯可以顯著逆轉上述變化。此外,IHC結果表明,PCPA大鼠下丘腦內GAD67的表達量較正常大鼠減少,柏子養心湯可上調GAD67的表達,表明柏子養心湯可促進下丘腦內Glu向GABA轉化。提示柏子養心湯可上調GAD67表達,促進Glu/GABA穩態平衡的恢復,從而改善失眠。

GABA通過GABA受體起作用[23]。大腦中的下丘腦含有大量的GABA受體。GABA受體有3種類型：GABAA、GABAB和GABAC。就睡眠而言,最重要的受體是GABAA受體。當GABA或其他激動劑與GABAA受體結合時,會觸發氯離子流入神經元細胞,導致抑制動作電位放電的負膜電位,因此,GABA通過激活GABAA受體降低腦細胞的活性[4]。GABAA受體共有19種亞基,以有限的組合組裝為功能性受體。大腦中主要的功能性GABAA受體多由α、β、γ亞基組成,其中2個α1亞基、2個β2亞基和1個γ2亞基構成的五聚體是最常見的GABAA受體亞型[24-25]。α1亞基的基因是GABRA1,β2亞基的基因是GABRB1,γ2亞基的基因是GABRG2。在本研究中,PCPA模型大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB1、GABRG2的mRNA和蛋白水平均低于正常大鼠,但柏子養心湯能呈劑量依賴性逆轉上述變化,表明柏子養心湯可增加PCPA大鼠下丘腦GABAA受體亞基(GABRA1、GABRB1、GABRG2)的表達量,提示柏子養心湯可提高失眠大鼠GABAA受體亞基的表達。

綜上所述,柏子養心湯可增加失眠大鼠NREM和REM睡眠總量,延長睡眠時間,改善睡眠質量,其作用機制可能與促進GABA的合成,提高GABAA受體α1、β2和γ2亞基的表達有關。本研究初步探索了柏子養心湯改善失眠的作用及潛在的分子機制,為其應用提供了理論參考。但柏子養心湯對失眠的改善機制尚需進一步的研究驗證;此外,除GABAA受體外,GABA也可通過GABAB受體發揮作用,柏子養心湯改善睡眠的分子機制是否與GABAB受體有關,在未來的研究中會進行補充實驗加以驗證。