Collagen1和Collagen3在牦牛肺纖維化組織中的表達研究

陳 平 何振富 王 斐 謝建鵬 何翃閎

（1甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所，甘肅 蘭州 730070；2青藏高原動物遺傳資源保護與利用重點實驗室，四川 成都 610041；3西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

牦牛生活在海拔3 000 m以上的高原地區，是高寒牧區特有的牛種資源［1］。牦牛對高寒低氧環境具有較強的適應性，為牧區人民提供了基本的生產生活資料，對牧區經濟的發展具有不可替代的作用［2-3］。高原地區空氣中的含氧量僅為海平面一半左右，牦牛可在低氧、低氣壓環境下生存，這與牦牛特殊的遺傳適應性結構有很大關系，如肺血管收縮緩慢、肺動脈壓低等［4］。肺是動物體呼吸系統重要的組成部分，也是機體供氧的重要器官，而膠原纖維、彈性纖維和平滑肌是肺結構的主要組成部分。膠原蛋白（collagen）是脊椎動物體內最豐富的分泌蛋白，約占總蛋白的1/3，在動物生命過程中不斷更新［5］，也是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的主要化合物，具有支撐器官和保護機體的作用［6-7］，可提供支架并引導細胞遷移、增殖和分化［8］。Ⅰ型膠原蛋白（Collagen1）和Ⅲ型膠原蛋白（Collagen3）是肺內主要的間質型膠原蛋白，Collagen1蛋白直徑較粗，伸張能力強，主要起支持作用；Collagen3直徑較細，柔韌性強［9］。Kim 等［10］研究發現，以膠原蛋白為主的ECM 在肺纖維化進程中起著重要作用，發生炎癥時成纖維細胞被過度激活，導致纖維化增殖并促使Collagen1 的合成［11-12］。Collagen1 和Collagen3 水平發生變化，將導致膠原合成代謝紊亂［13］，而ECM 過度沉積或降解都會導致肺纖維化，因此Collagen1 和Collagen3 可以作為反映纖維化的指標［14-15］。肺纖維化組織病理學檢查可見肺間質增生和ECM 過度沉積。但在肺纖維化組織中，Collagen1 與Collagen3 的相對表達量尚未研究，尤其是高寒地區特有動物。因此，本試驗探究Collagen1與Collagen3在牦牛肺纖維化不同階段的相對表達量，旨在為牦牛纖維化肺炎提供一定的理論基礎。本試驗還通過蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和Masson 染色及透射電鏡觀察正常組和試驗組組織結構變化；利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（western-blotting，WB）比較Collagen1 和Collagen3 在牦牛肺正常組和試驗組的表達差異；并運用免疫組織化學和免疫熒光染色研究Collagen1 和Collagen3 在正常組和試驗組肺組織中的分布特征，以期闡明Collagen1和Collagen3在牦牛肺發生纖維化進程中發揮的作用，為研究牦牛纖維化肺炎提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021年11月于甘肅省臨夏回族自治州，挑選健康和有嚴重呼吸道疾病的牦牛各6 頭，頸動脈放血致死后迅速解剖，取其肺組織，用生理鹽水沖洗干凈。將樣品分為3 份，第一部分做好標記迅速放入液氮，存于-80 ℃冰箱，用于RNA和蛋白的提取；第二部分浸泡于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖固定液中固定，用于HE染色和Masson 染色、免疫組織化學以及免疫熒光染色；最后一部分固定于戊二醛中，用于制作透射電鏡切片。

1.2 儀器與試劑

812 環氧樹脂包埋套裝、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染液，北京中鏡科儀技術有限公司；四氧化鋨，德國徠卡公司；TransZol、Evo M-MLV 反轉錄試劑盒、Go Taq?Green Master Mix 2×，美國Promega 公司；SYBR?Premix Ex Taq? Eraser?，大連TaKaRa 公司；Collagen1 抗體、Collagen3 抗體、Anti-GAPDH Mouse mAb、Goat antirabbit IgG-HRP antibody，蘇州江蘇親科生物研究中心有限公司；顯影定影試劑，武漢賽維爾生物科技有限公司；放射免疫沉淀法裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）、免疫組化試劑盒，北京索萊寶生物有限公司；ABI ViiA7 實時熒光定量PCR 儀，美國Life Technologies 公司；DP71 顯微照相裝置，日本Olympus公司；DP71 掃描成像儀，日本EPSON 公司；EM UC7 超薄切片機，德國徠卡；JEM-1400PLUS 透射電鏡，日本電子（JEOL）。

1.3 試驗方法

1.3.1 HE 和Masson 染色觀察 肺組織在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖固定液中固定48 h 以上，脫水，石蠟包埋，制作4 μm 石蠟切片。HE 染色觀察正常肺和發生纖維化肺組織的結構變化；Masson 染色（鐵-蘇木精染色5 min，Masson 染液染5 min，阿利新蘭染色2 min）觀察膠原纖維變化。

1.3.2 透射電鏡觀察 分別取正常和發生纖維化的肺組織，修剪為1 cm3大小的肺塊。經3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，脫水劑濃度梯度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100% 濃度中換3 次脫水劑），將脫完水的組織再經過脫水劑與環氧樹脂滲透液（脫水劑與環氧樹脂滲透液的比例分別為3∶1、1∶1、1∶3），每步30～60 min。將滲透好的樣品塊放到適當模具中，灌上包埋液包埋經過加溫聚合形成固體基質，即包埋塊，隨后采用超薄切片機制備約50 nm 的超薄切片，進行醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，利用JEM-1400PLUS透射電鏡觀察。

1.3.3 引物的設計與RNA 的提取和反轉錄 從GenBank 檢索牛（Bos taurus）Collagen1、Collagen3基因和β-actin基因的序列，用Primer Premier 6.0 軟件設計特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成，以β-actin作為內參基因，引物序列見表1。將-80 ℃冰箱儲存的牦牛肺組織樣品按照TransZol 說明書提取總RNA，再按照反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，存于-20 ℃條件下備用。

1.3.4Collagen1和Collagen3基因的擴增 以牦牛對照組和試驗組肺的cDNA為模板，對Collagen1、Collagen3和β-actin基因進行普通PCR 擴增。PCR 總反應體系為20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，無菌去離子水8 μL，Taq PCR Master Mix 10 μL。反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s；72 ℃終延伸5 min，40 個循環。將擴增后的PCR產物用2%的瓊脂凝膠進行核酸電泳。

1.3.5 qRT-PCR 檢測Collagen1和Collagen3基因在牦牛對照組和試驗組肺組織中的表達 使用實時熒光定量PCR 儀以β-actin為內參基因檢測Collagen1和Collagen3基因在牦牛對照組和試驗組肺組織中的表達水平。反應體系為20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL，無菌去離子水7.4 μL，SYBR?Premix Ex Taq? Eraser? 10 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，40個循環。每個樣品重復4 次。分析其熔解曲線，用SPSS 21.0 軟件對qRT-PCR 數據進行統計學分析，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3.6 制備牦牛肺組織蛋白樣品 將存于-80 ℃冰箱的肺組織樣品迅速轉移到用錫箔紙包被的研缽中，加入液氮用研杵充分研磨至粉末狀，各稱取0.1 g 至1.5 mL 離心管中，并加入RIPA 裂解液，冰浴搖床裂解1.5 h，吸取上清液，一部分存于-80 ℃備用，另一部分提取好的蛋白加入4×蛋白上樣緩沖液進行蛋白變性，用于WB檢測，保存于-20 ℃備用。

1.3.7 WB 檢測Collagen1 和Collagen3 蛋白的相對表達量 將變性好的組織樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，電泳結束后切膠，采用濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用脫脂牛奶封閉，然后于4 ℃條件下孵育一抗過夜，室溫孵育二抗2 h，PVDF膜上滴加化學發光液，采用掃描成像儀掃描條帶。用Image J 6.0測量灰度值，根據灰度值分析蛋白的表達量。

1.3.8 免疫組織化學對Collagen1和Collagen3蛋白定位 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖固定液充分浸泡固定組織，石蠟包埋后切片（4 μm），乙醇脫水，0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復。按照免疫組化試劑盒進行染色，滴加3% H2O2溶液，阻斷內源性過氧化物酶活性；滴加試劑盒A 液，濕盒內室溫孵育15 min，進行一抗反應，4 ℃過夜；滴加試劑盒B 液，濕盒內37 ℃溫箱孵育15 min；再滴加試劑盒C液，濕盒內37 ℃溫箱孵育15 min；滴加3，3-二氨基苯聯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片，顯微攝影觀察。

1.3.9 免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟至水，置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）抗原修復液（pH 值8.0）中，并于微波爐內進行抗原修復。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后滴加牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）封閉液封閉30 min，之后滴加一抗置于濕盒內4 ℃孵育過夜，陰性對照用PBS 代替一抗；PBS 清洗后，置于避光室溫條件下孵育熒光二抗50 min；滴加4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（4＇，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液，避光室溫孵育10 min；加入自發熒光淬滅劑作用5 min，之后流水沖洗10 min；切片風干后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡拍照觀察。

1.4 數據分析

試驗數據采用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析，每組重復3次，結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 HE和Masson染色結果

由HE 染色結果可見，對照組（圖1-a）肺組織結構完整，肺泡壁完整，結構清晰，肺泡隔無增厚，支氣管管腔和肺泡腔內無炎性滲出物，肺泡無炎性改變；試驗組（圖1-b）肺組織可見幾處片狀壞死，胞核碎裂溶解，并可見重度出血，大范圍肺水腫，肺泡腔內充滿嗜酸性蛋白樣物質，大范圍肺泡壁中度至重度增厚，伴有炎性細胞浸潤，部分肺泡萎縮，部分肺泡代償性增大，肺泡大小不一。Masson 染色時膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，相比對照組（圖1-c），試驗組（圖1-d）肺組織膠原纖維與肌纖維大量增生。

圖1 肺組織HE和Masson染色結果Fig.1 HE and Masson staining results of lung tissue

2.2 透射電鏡觀察

透射電鏡觀察結果如圖2顯示。對照組（圖2-a、b）肺組織形態結構較正常，血管開放性良好，I 型肺泡上皮細胞結構完整清晰，僅見Ⅱ型肺泡上皮細胞內部分粗面內質網擴張。試驗組（圖2-c、d）肺組織形態結構有明顯異常，電鏡下可見部分肺泡上皮細胞已裂解，細胞碎片散入肺泡腔內；少數血管內還可見中性粒細胞（炎癥反應）；Ⅰ型肺泡上皮細胞內線粒體已發生輕度腫脹，還可見少量空泡；Ⅱ型肺泡上皮細胞內多數粗面內質網已擴張呈至囊狀。

圖2 肺組織透射電鏡觀察圖Fig.2 Electron microscopic observation of lungs tissue

2.3 Collagen1和Collagen3基因的擴增

由圖3 可知，Collagen1、Collagen3和β-actin分別在131、258 和174 bp 處有單一明亮條帶，驗證了反轉錄后的引物和cDNA良好，可以用于后續試驗。

圖3 Collagen1、Collagen3和β-actin基因PCR產物的電泳分析結果Fig.3 PCR products of electrophoretic analysis result of Collagen1，Collagen3 and β-actin gene

2.4 qRT-PCR檢測結果

由圖4 可知，Collagen1基因在牦牛肺試驗組中的表達量顯著高于對照組（P＜0.05），Collagen3基因在牦牛肺對照組中的表達量極顯著高于試驗組（P＜0.01）；對照組Collagen3相對表達量極顯著高于Collagen1（P＜0.01），試驗組Collagen3相對表達量顯著高于Collagen1（P＜0.05）。

圖4 qRT-PCR檢測結果Fig.4 qRT-PCR results

2.5 Western-blotting檢測結果

WB 結果如圖5所示。Collagen1 和Collagen3 蛋白在肺對照組和試驗組中均有表達且差異顯著，其中Collagen1 蛋白在肺試驗組中的表達量顯著高于對照組（P＜0.05），而Collagen3 蛋白則在肺對照組中的表達量顯著高于試驗組（P＜0.05）；且試驗組、對照組中Collagen3 蛋白的表達量均顯著高于Collagen1 蛋白（P＜0.05）。

圖5 Collagen1和Collagen3蛋白的檢測結果及相對表達量Fig.5 The detection results and relative expression of Collagen1 and Collagen3 proteins

2.6 免疫組化檢測Collagen1 和Collagen3 蛋白的分布

由圖6 可知，Collagen1 和Collagen3 蛋白在對照組和試驗組中均有分布，棕褐色表示Collagen1 和Collagen3 蛋白的陽性表達產物。Collagen1 蛋白同Collagen3 蛋白主要分布于細支氣管黏膜上皮的克拉拉細胞、纖毛細胞和外膜平滑肌細胞、肺泡隔以及伴隨動脈和平滑肌細胞中。

圖6 Collagen1和Collagen3蛋白在牦牛肺組織中的分布Fig.6 Distribution of Collagen1 and Collagen3 protein in lung tissue of yak

2.7 免疫熒光染色檢測結果

免疫熒光染色結果顯示，在牦牛肺對照組（圖7-a、b），Collagen1 蛋白主要分布于細支氣管和終末細支氣管的克拉拉細胞、纖毛細胞、外膜平滑肌和伴隨動脈內皮細胞、平滑肌以及少量肺泡隔中；Collagen3蛋白在肺泡隔中只有極少量分布，其余分布位置同Collagen1。在試驗組（圖7-c、d）中，Collagen1 和Collagen3 蛋白大量增生，在肺泡隔中有大量分布，其余分布位置同對照組，但表達均強于對照組。

3 討論

3.1 肺纖維化病理學檢查與發生機制

急性肺損傷早期，肺成纖維細胞過度活化，出現纖維化增殖，產生膠原蛋白，從而啟動肺纖維化過程［16-17］。本研究病理組織學檢查顯示，病變肺組織結構異常紊亂，肺泡間隔增寬，大范圍肺泡壁中度至重度增厚，伴有炎性細胞浸潤，肺泡大小不一，大量膠原及基質增生，呈典型纖維化。肺纖維化主要是肺間質、肺泡、肺小血管或末梢氣道發生不同程度的炎癥，導致肺泡結構破壞，形成肺泡腔內完全型纖維化，在炎癥損傷和修復過程中形成肺纖維化［18-19］，肺纖維化機制涉及大量的細胞因子和生長因子，膠原蛋白降解需要基質金屬蛋白酶來完成，其活性受金屬蛋白酶組織抑制物抑制。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能夠誘導肺成纖維細胞生成活性氧（reactive oxygen species，ROS），并促進ERK1/2通路的激活，導致Collagen1、Collagen3mRNA 相對水平和合成增加［20-21］。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可能通過上調Hippo信號通路中Yap1 的表達和TGF-β1/Smad 信號通路中Smad2/3 的表達，促進Collagen1 合成，誘導大鼠肺纖維化［15］。本研究牦牛病變組織結構異常，推測該牦牛發生了急性肺損傷，產生了大量生長因子，從而促進了ERK1/2通路的激活，導致膠原蛋白合成增加。

3.2 中草藥改善肺纖維化部分機制

前人研究發現，部分中草藥可顯著抑制肺纖維化進程，滇龍膽草通過抑制MAPK 信號通路可改善小鼠肺纖維化的影響，Collagen1 蛋白水平顯著下調［22］；由缺氧導致肺間質肌成纖維細胞化進程相關的Collagen1、Collagen3 指標明顯上調，黃芩苷干預后Collagen1、Collagen3 指標明顯下調，可有效抑制肺纖維化［23］。姜黃素通過調節博萊霉素誘導大鼠肺組織膠原蛋白周轉、組裝和沉積來防止纖維化沉積［24］。本試驗中，在病變肺組織中，Collagen3 的表達量高于Collagen1，推測可能處于肺纖維化早期，因此，可通過檢測Collagen1 和Collagen3 的含量來反映牦牛肺纖維化的病程或病變活動情況。后續在研究富含多酚類物質的中草藥改善肺纖維化時，可通過中草藥經信號通路調節Collagen1、Collagen3水平作為判斷依據。

3.3 Collagen1和Collagen3在纖維化肺中的表達

Collagen1 和Collagen3 在不同動物肺臟表達形式不同。馬躍文等［25］研究發現，鼠的肺支氣管周圍以及肺泡間隔中可見Collagen1 和Collagen3，且Collagen1的含量比Collagen3 高。本研究免疫組化結果發現，Collagen1 和Collagen3 也在牦牛肺細支氣管和肺泡間隔中有分布，與前人發現的分布部位一致，但qRTPCR 和WB 結果表明，牦牛正常肺組織中Collagen1 的含量比Collagen3 低，與前人結果相反，推測是由于牦牛具有肺低氧適應性結構，高海拔地區牦牛肺泡隔的厚度大于低海拔地區，而肺泡隔中含有大量的Collagen3［26］，因此推測本研究正常肺Collagen1 的表達量低于Collagen3，可能是高海拔地區牦牛肺泡隔Collagen3 高表達所致。Taniwaki 等［27］發現，一些組織器官如肺、腎、肝等在開始發生纖維化時，其上皮合成Collagen4 的能力轉變為合成Collagen1 和Collagen3。當組織器官纖維化轉變為慢性后，則以Collagen1 沉積為主，Collagen1 和Collagen3 比例失調，膠原代謝紊亂，導致膠原在肺間質中沉積，肺組織基質結構紊亂，從而發生纖維化［28］。張燕萍等［29］研究闡述了Collagen1 和Collagen3 的升高或降低影響肺纖維化程度，Collagen1的過度沉積在肺間質纖維化進程中發揮了至關重要的作用，Collagen3 主要分布在肺間質，在肺纖維化組織中變化最明顯。Abraham 等［30］研究發現，肺纖維化時成纖維細胞釋放以Collagen1 和Collagen3 為主的膠原蛋白。本試驗免疫組化和免疫熒光結果發現，Collagen1 和Collagen3 在試驗組大量增生，除在肺泡隔中有大量分布外，在對照組和試驗組中的分布位置基本一致，均分布在細支氣管黏膜上皮組織和平滑肌組織，伴隨動脈內皮和平滑肌等肺間質中，且在試驗組中呈強陽性分布。由此推測本研究中試驗組牦牛患有巴氏桿菌病或纖維素性肺炎所致的急性肺損傷，導致其肺組織結構紊亂，膠原蛋白大量分布。

4 結論

Collagen1 和Collagen3 在牦牛對照組和試驗組肺組織中均有表達且存在表達差異，Collagen1 在牦牛試驗組中的表達量顯著高于對照組，Collagen3 在牦牛對照組中的表達量顯著高于試驗組。Collagen1 和Collagen3 主要分布在對照組和試驗組肺組織的細支氣管黏膜上皮組織、平滑肌組織以及肺泡隔，伴隨動脈內皮和平滑肌等肺間質中。綜上，Collagen1 和Collagen3 在牦牛發生肺纖維化的過程中發揮著重要作用。