宰后羊肉中環腺苷酸依賴蛋白激酶活性變化和影響因子研究

宋旭博 擺玉薔 王振宇 李 欣，* 侯成立 方 菲 余群力，* 張德權

（1甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2中國農業科學院農產品加工研究所/農業農村部農產品質量安全收貯運管控重點實驗室 北京 100193）

環腺苷酸依賴蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase，PKA）是催化蛋白質磷酸化反應的重要蛋白激酶之一，通過將三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）或三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）上的磷酸基團轉移到蛋白質特定氨基酸殘基上，使蛋白質發生磷酸化修飾［1］。真核細胞中發生磷酸化修飾的位點為絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基側鏈的羥基。研究表明，蛋白質磷酸化主要通過調節酶活性而影響蛋白質降解、宰后糖酵解進程，進而調控肉品質［2-4］。PKA 廣泛存在于真核細胞，可催化絲氨酸、蘇氨酸發生磷酸化，PKA 全酶是由兩個催化亞基和兩個調節亞基組成的四聚體，沒有催化活性，其活化依賴第二信使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的催化。PKA 全酶調節亞基上包含兩個cAMP 結合位點，當結合cAMP 分子后，其構象發生變化，釋放催化亞基，使PKA 具有催化活性。目前已證實哺乳動物有250 多種PKA 磷酸化底物，所有這些蛋白組成了細胞的PKA 信號網絡［5］。

PKA 活性受鈉離子、cAMP、ATP 影響［6-8］。研究表明，PKA 可催化肌原纖維蛋白發生磷酸化反應［7］。Motoko 等［9］研究發現，飼喂鈉鹽可顯著抑制大鼠肌肉中PKA 等多種激酶活性，降低蛋白質磷酸化水平。此外，氯化鈉腌制羊肉后顯著降低了PKA 活性及肌肉糖酵解限速酶和骨架蛋白磷酸化水平［6］，可見，鈉離子是影響PKA 活性的一個重要因素。李常青等［8］發現，外源cAMP 進入細胞內可提高體內cAMP 的濃度并激活PKA，使代謝酶活性增強，底物蛋白質發生磷酸化。可見，cAMP是影響PKA活性的又一重要因素。

通過調控PKA 活性改變肉中蛋白質磷酸化水平，是從分子水平調控肉品質的重要途徑。已有研究證實，肌漿蛋白的整體磷酸化水平與肉色穩定性呈負相關關系［10］，離體條件下，PKA 影響糖原磷酸化酶的磷酸化水平和活性［11］。此外，PKA可催化μ-鈣蛋白酶發生磷酸化反應，其磷酸化反應可正向調控μ-鈣蛋白酶的活性［12］，蛋白質磷酸化通過影響酶活性和蛋白質結構穩定性而調控宰后肌肉僵直的進程，進而影響肌肉嫩度［13］。研究表明，蛋白質整體磷酸化水平高的肉嫩度低、持水力低、腌制速率慢、食鹽使用量高，可見，原料肉蛋白質磷酸化水平是影響腌制效果的重要因素［14-15］。

明確PKA 活性是否隨宰后時間變化及其變化在不同品質肉中是否一致對闡明PKA 活性對宰后肉品質的影響有重要意義。但宰后不同時間、不同品質肉中PKA 活性變化以及肉中鈉離子、cAMP 等因素對PKA 活性的影響尚不清楚。因此，本研究重點解析不同品質肉中PKA 活性隨宰后時間的變化，以期為研發基于PKA活性的生鮮肉品質調控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購自瑞士Roche 公司；Pro-Q Diamond染色液、SYPRO Ruby染色液購自美國Invitrogen公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris Base）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等均為分析純，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；ATP含量檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；環腺苷酸依賴蛋白激酶（PKA）活性檢測試劑盒、環磷酸腺苷（cAMP）含量檢測試劑盒購自北京金天然科技發展有限公司；BCA Protein Assay Kit 蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 儀器與設備

Spark?多功能微孔板檢測儀，瑞士Tecan 公司；Ultra Turrax Dispersen S25 勻漿機，德國IKA 公司；MJ-Ⅱ霉菌培養箱，上海一恒科技有限公司；TS-2 水平脫色搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Mini-PROTEAN Tetra System 電泳設備、ChemiDocTMMP凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；TA-XT2i/5質構分析儀，英國Stable Micro System 公司；CM-600D 色差計，日本柯尼卡-美能達公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 選取64 只6～7月齡，體重為（38.94±2.11）kg的小尾寒羊公羊雙側背最長肌，分裝至凍存管中，于4 ℃條件下貯存，在宰后1 h、12 h、1 d、3 d、5 d 時取樣，每個時間點的樣本，取一部分用于肉品質分析，另一部分經液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱，用于生化指標分析。根據宰后1 d的剪切力、a*值和蒸煮損失將樣品分為高品質組（剪切力小、a*值大、蒸煮損失低）和低品質組（剪切力大、a*值小、蒸煮損失高），共18只，每組包含9個樣本。

1.3.2 剪切力測定 參照《NY/T 1180-2006 肉嫩度的測定 剪切力測定法》［16］測定。將背最長肌剔除筋膜，并沿肌纖維方向修整成6 cm×6 cm×3 cm 的肉塊，放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱至肉樣中心溫度達到70 ℃時，將肉樣取出冷卻至室溫，切成1 cm×1 cm×3 cm 的小塊，用質構分析儀垂直于肌肉纖維方向剪切測定其剪切力（N）。探頭距離為25 mm，速度為60 mm·min-1。每個樣品測定5次。

1.3.3 蒸煮損失測定 蒸煮損失測定參照Honikel等［17］的方法。取羊背最長肌稱重并記質量為W1，放入蒸煮袋中封口包裝，于80 ℃水浴45 min 后，冷卻至室溫并置于4 ℃過夜。將肉塊取出，用濾紙輕輕吸干表面汁液，再次稱重記質量為W2。蒸煮損失計算方法如下：

1.3.4a*值測定 利用色差計測定肉表面色澤，將肉樣的新切橫斷面在室溫下氧合30 min，垂直將色差計鏡頭置于肌肉橫斷面，鏡頭緊扣肉面，保證不漏光，隨機在每個樣品4個不同位置上各測定1次，測定位置均勻分布于肌肉橫切面。采用標準光源CIEL*a*b*系統，測定前利用亮度值（L*）=97.59±0.01、紅度值（a*）=0.07±0.02、黃度值（b*）=1.60±0.00的白板對色差計進行校正。

1.3.5 PKA 活性測定 稱取0.1 g 樣品，加入0.9 mL 0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），冰浴勻漿2 次，2 檔，每次15 s，間隔30 s，于10 000 r·min-1（4 ℃）離心30 min，上清液即為所需的樣品溶液。根據PKA 活性測定試劑盒說明建立反應體系，充分混合后，在450 nm 處測定吸光度值。根據建立的標準曲線計算PKA活性。

1.3.6 鈉離子含量測定 根據《GB 5009.91-2017食品安全國家標準 食品中鉀、鈉的測定》［18］，配制Al（NO3）3/KNO3（0.5 mol·L-1和1.1 mol·L-1）、絡合劑NH4HF（300 g·L-1）、Na2SO4標準溶液（0.4 mol·L-1），使用溫度滴定法，稱取1 g 樣品，攪碎備用，分別添加1.0、1.5、2.0、2.5 mL Na2SO4，再加5 mL絡合劑和40 mL蒸餾水，用Al（NO3）3/KNO3滴至第一個終點，得到滴定曲線，按照公式計算鈉離子含量：

式中，X為樣品中元素含量（mg·100g-1）；C為測定試樣液中元素濃度（μg·mL-1）；C0為試劑空白液中元素濃度（μg·mL-1）；V為試樣液定容體積（mL）；f為樣品液稀釋倍數；m為樣品質量（g）。

1.3.7 ATP 含量測定 稱取0.1 g 樣品，參照ATP含量檢測試劑盒說明書，加入1 mL 10 倍體積的提取液，冰浴勻漿2 次，1 檔，每次15 s，間隔30 s，于8 000 r·min-1（4 ℃）離心10 min，取上清，加入500 μL氯仿，震蕩混勻后10 000 r·min-1離心（4 ℃）3 min，上清液即為所需樣品溶液，然后按照說明書建立反應體系，充分混合后，立即測定340 nm下的吸光值（A測定），然后將酶標板放入37 ℃培養箱中反應3 min，立即取出測定340 nm 下的吸光值（A標準），按照公式計算ATP 含量（μmol·g-1）：

式中，A測定=A2測定管-A1測定管；A標準=A2標準管-A1標準管；W為樣本質量（g）。

1.3.8 cAMP含量測定 稱取0.1 g樣品，加入0.8 mL 0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液，冰浴勻漿2次，2檔，每次15 s，間隔30 s，于3 000 r·min-1離心（4 ℃）30 min，上清液即為所需樣品溶液，根據cAMP 含量測定試劑盒說明建立反應體系，充分混合后，在450 nm 處測定吸光度值。根據建立的標準曲線計算cAMP含量。

1.3.9 肌漿蛋白磷酸化水平測定 肌漿蛋白提取參考Lametsch 等［19］的方法，并略作修改。取-80 ℃凍存的肉樣1 g，加入6 倍體積的緩沖液（10 mmol·L-1Tris Base，10 mmol·L-1DTT，蛋白酶抑制劑50 mL，磷酸酶抑制劑50 mL）后冰上高速勻漿2次，每次10 s，間隔30 s，所得的勻漿液于10 000 r·min-1離心（4 ℃）30 min，上清液即為所需肌漿蛋白樣品，稀釋10倍后按BCA 法測定蛋白濃度，根據測定濃度，調節所需濃度為4 μg·mL-1，與上樣緩沖液（10 % SDS、甘油、0.5 mol·L-1Tris，HCl調pH 值到6.8、1 mol·L-1DTT、溴酚藍）1∶1 混合均勻，100 ℃水浴5 min，分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。采用10%分離膠和4%濃縮膠，參考Chen 等［20］的方法測定肌漿蛋白磷酸化水平，蛋白上樣量為5 μg，電泳初始電壓為80 V，待蛋白進入分離膠后調整電壓為120 V，至蛋白到達離凝膠底部5 mm 處停止電泳。電泳結束后至成像前所有操作均在搖床上進行。凝膠在固定液（10%乙酸，50%乙醇）中固定（2 次，30 min/次），超純水洗（3 次，10 min/次），Pro-Q Diamond 染色液避光染色80 min后Pro-Q 脫色液（20%乙腈，50 mmol·L-1乙酸鈉，pH 值4.0）脫色（2 次，30 min/次），超純水洗（3 次，10 min/次），進行磷酸化蛋白染色成像；SYPRO Ruby染色液避光染色4 h，Ruby脫色液（7%乙酸，10%乙醇）脫色（2次，30 min/次），超純水洗（3次，10 min/次）。

采用ChemiDocTMMP 凝膠成像系統進行圖像掃描。Pro-Q Diamond 染色后在激發波長532 nm、發射波長580 nm、分辨率200 mm 的條件下掃描。SYPRO Ruby 染色后在激發波長532 nm、發射波長610 nm、分辨率200 mm的條件下掃描。

運用Quantity One 軟件對經熒光染液染色聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE）蛋白條帶的光密度值進行分析，得到每個條帶的磷酸化蛋白染色（Pro-Q Diamond）光密度值（P）和全蛋白染色（SYPRO Ruby）光密度值（T），同一條帶的磷酸化蛋白與全蛋白光密度值之比P/T 即為該條帶蛋白質磷酸化水平，樣品整體磷酸化水平為其泳道上所有蛋白條帶的P/T 值之和。

1.4 數據處理

采用Excel 2016軟件處理數據，指標均為3次重復3 次平行的測定結果，結果用平均值±標準偏差表示。利用SPSS Statistics 21 軟件對試驗結果進行雙因素方差分析，其中方差分析時選取一般線性模型，品質分組和宰后時間為固定因子，采用最小顯著差異法進行顯著性分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同品質組肉樣宰后1 d的a*值、剪切力、蒸煮損失分析

兩個品質組宰后1 d 的a*值、剪切力、蒸煮損失結果表明，高品質組的a*值顯著高于低品質組，剪切力、蒸煮損失顯著低于低品質組（表1）。

2.2 不同品質組肉樣PKA活性隨宰后時間的變化

由圖1可知，宰后1 h和12 h低品質組的PKA 活性顯著高于高品質組（P＜0.05），宰后1、3、5 d 高品質組與低品質組PKA 活性差異不顯著（P＞0.05）。高品質組PKA 活性在宰后1 h、12 h、1 d 時顯著低于3、5 d，低品質組中PKA 活性在宰后1 h、12 h、1 d、3 d 時顯著低于5 d（P＜0.05）。

圖1 不同品質組肉樣中PKA活性隨宰后時間的變化Fig.1 Changes of PKA activity in meat samples of different quality groups with postmortem time

2.3 不同品質組肉樣ATP含量隨宰后時間的變化

由圖2 可知，隨著宰后時間的延長，不同品質差異組ATP 含量在宰后1 h～3 d 顯著降低（P＜0.05），3～5 d差異不顯著，均在宰后5 d 時ATP 含量趨近于零。宰后1 h 和5 d 時，兩個品質組間ATP 含量差異不顯著（P＞0.05）。高品質組的ATP 含量在宰后12 h 和3 d 顯著高于低品質組，在宰后1 d 顯著低于低品質組（P＜0.05）。

圖2 不同品質組肉樣ATP含量隨宰后時間的變化Fig.2 Changes of ATP content in meat samples of different quality groups with postmortem time

2.4 不同品質組肉樣cAMP含量隨宰后時間的變化

由表2可知，高品質組cAMP含量顯著高于低品質組（P＜0.05）。高品質組cAMP 含量在宰后1、12 h顯著高于1、3、5 d（P＜0.05），不同宰后時間低品質組cAMP含量差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同品質組肉樣cAMP含量隨宰后時間的變化Table 2 Changes of cAMP content in meat samples of different quality groups with postmortem time /（nmol·L-1）

2.5 不同品質組肉樣鈉離子含量隨宰后時間的變化

由圖3 可知，宰后不同時間高品質組和低品質組中鈉離子含量無顯著差異，不同品質組樣本鈉離子含量在宰后不同時間差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同品質組肉樣鈉離子含量隨宰后時間的變化Fig.3 Changes of sodium ion content in meat samples of different quality groups with postmortem time

2.6 不同品質組肉樣肌漿蛋白磷酸化水平隨宰后時間的變化

兩個品質組中肌漿蛋白磷酸化水平隨宰后時間變化結果如圖4所示。圖5 是SYPRO Ruby 染色的肌漿全蛋白質。從圖中選取24 個較清晰的蛋白質條帶進行整體磷酸化水平分析。整體上，在宰后1、3、5 d 時，低品質組肌漿蛋白磷酸化水平顯著高于高品質組（P＜0.05），且不同蛋白質條帶磷酸化水平的影響呈現出差異。兩個品質組肌漿蛋白磷酸化水平在宰后1 h 顯著高于12 h、1、3、5 d（P＜0.05）。

圖4 不同品質組肉樣肌漿蛋白磷酸化水平隨宰后時間的變化Fig.4 Changes of phosphorylation levels of sarcoplasmin in different quality groups with postmortem time

圖5 肌漿蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE image displaying the sarcoplasmic protein content

2.7 相關性分析結果

PKA 活性與鈉離子、cAMP、ATP 含量、肌漿蛋白磷酸化水平的相關性分析結果如表3所示。結果表明，PKA活性與ATP含量（r=-0.73，P＜0.05）、cAMP含量（r=-0.84，P＜0.05）和肌漿蛋白磷酸化水平（r=-0.80，P＜0.05）呈顯著負相關；與鈉離子含量呈顯著正相關（r=0.80，P＜0.05）。

表3 PKA活性與ATP、cAMP、鈉離子含量、肌漿蛋白磷酸化水平的相關性分析Table 3 Correlation analysis of PKA activity with ATP，cAMP，sodium content and sarcoplasmic protein phosphorylation

3 討論

3.1 不同品質組PKA活性隨宰后時間變化分析

PKA 活性影響宰后肉蛋白質磷酸化水平，進而影響肉品質。研究表明，肌漿蛋白磷酸化通過調控糖酵解酶活性使宰后pH 值下降，進而間接調控肉色［21］。低肌原纖維蛋白磷酸化水平有助于肌原纖維蛋白被鈣蛋白酶降解，減輕肌肉收縮進而改善保水性［22］，蛋白質磷酸化可通過調控糖酵解、肌肉收縮等環節影響宰后肌肉嫩度［9］。本研究結果表明，低品質組PKA 活性在宰后1、12 h顯著高于高品質組。PKA發揮活性需要ATP 參與，腺苷酸環化酶催化ATP 生成cAMP［14］，隨著宰后時間延長，高品質組的ATP 消耗緩慢，抑制cAMP的生成，進而影響PKA 活性。兩個品質組PKA 活性在宰后1 h、12 h、1 d時顯著低于5 d。PKA全酶呈非活性狀態，在其調節亞基上有兩個cAMP 結合位點，當cAMP 存在時，與調節亞基結合后，調節亞基與催化亞基分離，釋放出的催化亞基活化PKA［22］。隨著宰后cAMP 與調節亞基結合，cAMP 被消耗，其含量下降，從而激活PKA并使其活性增加。

3.2 肌漿蛋白磷酸化水平分析

蛋白質磷酸化在調節宰后肌肉的生理生化過程，如糖酵解、肌肉收縮、細胞凋亡等過程中起重要作用，可影響肉的嫩度、持水性、肉色穩定性等品質［23］。本研究結果表明，低品質組的肌漿蛋白磷酸化水平在宰后1、3、5 d顯著高于高品質組，這與陳立娟［7］的研究結果一致。肌漿蛋白整體磷酸化水平受品質、宰后時間影響［14］。究其原因，第一，根據“磷酸化誘導酶活降低”學說，磷酸化水平越高糖酵解酶活性越低［24-25］，因此，在磷酸化作用的影響下，高嫩度組糖酵解酶活性較高、糖酵解速率較快、pH 值較低，更有利于組織蛋白酶釋放和激活，促進蛋白質降解，進而有利于肉的嫩化［26］。第二，宰后胴體進行無氧反應產生ATP 的含量不足，而蛋白質磷酸化發生的必要條件是有ATP 提供磷酸基團。ATP作為蛋白質磷酸化反應的介質直接影響蛋白質磷酸化，但隨著宰后時間的延長，ATP逐漸被消耗，使磷酸化水平下降，因此，肌漿蛋白磷酸化水平在宰后1、3、5 d 顯著低于1 h。研究發現，蛋白質磷酸化影響肉色穩定性、能量代謝等［12，27-28］。蛋白激酶是影響蛋白質磷酸化的重要內源因子［12］。PKA 作為一種蛋白激酶，其作用是催化蛋白質發生磷酸化。本試驗結果表明，PKA 活性與肌漿蛋白磷酸化水平呈負相關，這可能是由于PKA 有許多亞型，且各亞型的功能各不相同，本試驗僅測定分析了總PKA 活性，而各亞型活性變化還有待繼續研究。

3.3 影響PKA活性的因素分析

鈉離子含量是影響PKA 活性的重要因素，張彩霞［6］指出食鹽顯著抑制PKA 活性。本研究結果表明，同一宰后時間不同品質組和同一品質組不同宰后時間鈉離子含量均無顯著差異，相關性分析發現，PKA活性與鈉離子含量呈顯著正相關。本研究重點解析宰后肉中所含鈉離子對PKA 活性的影響，明確肉中本底鈉離子與PKA 活性的關系，研究結果表明，宰后肉中鈉離子含量對PKA 活性的影響不隨宰后時間與肉品質變化而變化。cAMP 是細胞內最重要的第二信使，細胞內cAMP 濃度的改變影響多種細胞內信號轉導途徑，從而調控蛋白活性、基因表達等，進而影響細胞代謝、生長和凋亡過程［29］。PKA 的活化主要受胞內cAMP 濃度的影響［30］，腺苷酸環化酶與G 蛋白耦聯受體結合活化，在質膜內催化ATP合成cAMP，cAMP與PKA的調節亞基結合，可促使其催化亞基釋放，催化亞基會進一步作用于cAMP 反應元件結合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，CREB），促進其磷酸化為pCREB，pCREB 可以介導神經元對各種神經營養因子包括腦源性神經營養因子、神經生長因子的反應［31-33］。在蛋白質磷酸化反應的過程中，通過消耗生成的cAMP 激活PKA，進而使蛋白質發生磷酸化反應，表現為PKA活性與cAMP含量呈顯著負相關，PKA 活性隨cAMP含量的降低而逐漸升高。但如何通過鈉離子濃度影響PKA活性進而調控肉品質還需進一步深入研究。

4 結論

宰后肉中PKA 活性受宰后時間和肉品質的影響，PKA 活性隨宰后時間的延長而升高，且與宰后肉中鈉離子含量呈顯著正相關，cAMP 通過影響PKA 活性而影響肌漿蛋白磷酸化水平，進而影響肉品質，說明cAMP 含量與鈉離子是影響PKA 活性的重要因素。進一步研究重點在于通過改變鈉離子濃度影響PKA 活性進而調控肉品質。