貴州白山羊PRDM16基因變異及生物信息學(xué)分析

陳敏 黃明捷 劉霜云 盤祖香 劉江靜 游敏芳

(黔東南苗族侗族自治州畜牧技術(shù)推廣站，貴州 凱里 556000)

貴州白山羊是我國著名的地方白山羊品種，主要分布于貴州的遵義、銅仁、黔東南等地區(qū)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)等特性，是貴州省重要的畜牧種質(zhì)資源。近年來，因?yàn)樽匀缓腿藶榈纫蛩貙?dǎo)致貴州白山羊品種性能退化，個體生產(chǎn)性能差異過大，因此合理開發(fā)利用及保護(hù)貴州白山羊的種質(zhì)資源迫在眉睫。

PRDM16基因(PR結(jié)構(gòu)域蛋白16)又稱MELI，而MELIS為MELI基因表達(dá)的另一蛋白產(chǎn)物，但MELIS缺少了PR結(jié)構(gòu)域(PRD)，該結(jié)構(gòu)對于PRDM16功能的發(fā)揮具有重要作用[1]。PRDM16基因存在高度同源性，該基因位于人類1號染色體上，是PR結(jié)構(gòu)域家族中第16個成員。人類的PRDM16蛋白由1276個氨基酸組成[2]。PRDM家族中PRDM3與PRDM16在早期造血過程中起到重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PRDM16基因變異與超重肥胖遺傳機(jī)制具有一定關(guān)聯(lián)性[4]。還有研究表明，PRDM16能調(diào)控小鼠脂肪肌肉的分化方向[5]。但山羊PRDM16基因相關(guān)的研究尚未見報(bào)道。綜上，PRDM16基因可以作為貴州白山羊遺傳育種改良的一個重要候選基因進(jìn)行相關(guān)研究。本研究應(yīng)用混合PCR測序方法檢測PRDM16基因在貴州白山羊中的核苷酸變異結(jié)合生物信息學(xué)方法分析編碼蛋白的分子特征，以期為后續(xù)利用PRDM16基因改良貴州白山羊種質(zhì)資源提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以貴州不同地區(qū)128只白山羊作為實(shí)驗(yàn)對象，頸靜脈采采集血樣約5.0mL保存，提取全基因組DNA，并將所得DNA稀釋至相同濃度進(jìn)行混合，用于后續(xù)PCR混合測序。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI中GeneBank山羊的PRDM16基因序列(登錄號：NC_030823)，利用 Premier 5.0在線設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增該基因9755-10366區(qū)域，用于檢測核苷酸變異，引物見表1，由上海生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系40μL，其中20μL的2×Master Mix，上下游混合引物各2μL，14μL的無菌雙蒸水，2μL的DNA模板。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性溫度為94℃(4min)；變性溫度為94℃(30s)；退火溫度為60℃(30s)；延伸溫度為72℃(30s)；38個循環(huán)，72℃延伸10min。產(chǎn)物4℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，150V電泳15min。將檢測無誤的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

表1 PCR引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Lasergene的MegAlign程序分析貴州白山羊PRDM16的核苷酸變異；利用生物軟件PopGene32計(jì)算得到PRDM16基因的基因型頻率、等位基因頻率、Hardy-Weinberg平衡P值，利用PIC計(jì)算軟件得到其多態(tài)信息含量。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用在線工具ExPASy的ProtParam tool(https：//web.expasy.org/protparam/)分析理化性質(zhì)；利用ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)預(yù)測親水性及疏水性結(jié)構(gòu)。利用TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析亞細(xì)胞定位；利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜區(qū)；利用SignaIP(http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽區(qū)域；利用Net Phos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析磷酸化位點(diǎn)；利用PredictProtein(http：//www.predictprotein.org/)和SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)分別預(yù)測分析二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；在NCBI的GeneBank中分別下載保存牛、豬、雞、犬等物種PRDM16的CDS序列，利用DNAStar軟件分析其同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用STRING(https：//string-db.org/)在線系統(tǒng)分析互作蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因編碼區(qū)擴(kuò)增

將貴州白山羊PRDM16基因作為DNA模板，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)目的條帶與預(yù)期相同，約612bp，見圖1a，可用于后續(xù)檢測。混合PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)該序列存在g.342 G/A核苷酸突變，見圖1b。

圖1 貴州白山羊PRDM16基因PCR產(chǎn)物及測序結(jié)果

2.2 貴州白山羊PRDM16基因多態(tài)性分析

貴州白山羊PRDM16基因中共有2種等位基因(A和G)，其頻率分別為36.97%、63.03%；有3種基因型，即AA、AG、GG，其頻率分別約為13.67%、46.60%、39.73%，如表2所示。由多態(tài)信息含量以及表2可知，本實(shí)驗(yàn)貴州白山羊PRDM16基因在群體中屬于低度多態(tài)(0.5>PIC>0.25)，該基因在群體遺傳中并處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P=0.03)。

表2 貴州白山羊PRDM16基因遺傳特征

2.3 PRDM16基因蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用在線工具ProtParam分析PRDM16蛋白的理化性質(zhì)，各氨基酸的組成如表3所示。PRDM16的CDS區(qū)長3814bp，共編碼1271個氨基酸，分子式為C6133H9545N1717O1904S57，原子總數(shù)為19356個，相對分子質(zhì)量為139624.04kU，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為172個，帶正電荷的殘基總數(shù)為143個，親水性平均值(GRAVY)為-0.671，脂肪族指數(shù)為62.77，估計(jì)半衰期為30h，不穩(wěn)定指數(shù)為58.72，理論等電點(diǎn)(PI)為5.93，說明為酸性不穩(wěn)定蛋白。

表3 PRDM16蛋白編碼氨基酸組成

2.4 親/疏水性的分析

利用在線系統(tǒng)ProtScale分析貴州白山羊PRDM16蛋白的親/疏水性，所得結(jié)果如圖2，其表明第556號的氨基酸親/疏水性最大(1.867，正值)，第632和634號的氨基酸親/疏水性最小(-3.133，負(fù)值)。與前面理化性質(zhì)分析的結(jié)果相符合，總體表現(xiàn)為親水性。

2.5 亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)及信號肽分析

利用在線工具TargetP分析PRDM16蛋白亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果表明該蛋白位于胞外；利用TMHMM分析PRDM16蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，見圖3a，該蛋白沒有跨膜區(qū)，表明其不是跨膜蛋白或者無法于細(xì)胞膜上定位；利用SignaIP分析該蛋白的信號肽區(qū)域，結(jié)果如圖3b所示，不存在信號肽區(qū)域。

圖3 貴州白山羊PRDM16跨膜區(qū)與信號肽區(qū)域分析

2.6 PRDM16蛋白結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

利用在線系統(tǒng)Prosite預(yù)測PRDM16蛋白的結(jié)構(gòu)域，見圖4a，結(jié)果表示有9段氨基酸序列吻合ZINC蛋白的結(jié)構(gòu)域，分別是278～305、306～333、334～362、363～390、391～418、420～447、947～974、975～1003、1004～1031；利用在線軟件Net Phos 3.1分析該蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果如圖4b所示，其存在141個磷酸位點(diǎn)，其中酪氨酸19個，蘇氨酸39個絲氨酸83個。

2.7 PRDM16蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

分別利用PredictProtein和SWISS-MODEL預(yù)測貴州白山羊PRDM16蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)，見圖5，結(jié)果表明，其二級結(jié)構(gòu)中α螺旋(Alpha helix)占27.22%，β折疊(Beta turn)占5.11%，伸展鏈(Extended strand)占7.16%，無規(guī)則卷曲(Random coil)占60.50%。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果說明其三級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，見圖6。

圖5 貴州白山羊PRDM16二級結(jié)構(gòu)預(yù)測示意圖

圖6 貴州白山羊PRDM16三級結(jié)構(gòu)預(yù)測示意圖

2.8 同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI的GeneBank中分別檢索到山羊(NC_030823)、牛(NC_037343.1)、狗(NC_006587.4)、豬(NC_010448.4)、雞(NC_052552.1)、馬(NC_009145.3)、鴨(NC_048913.1)、鱒魚(NC_048573.1)、溝鼠(NC_051340.1)和龜(NC_024234.1)的PRDM16基因編碼的序列，接著利用軟件DNAstar 7.0進(jìn)行同源性分析，見圖7a，且構(gòu)建得到一個系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖7b。同源性比較結(jié)果表明，山羊與牛的同源性最高(97.1%)，而與鱒魚同源性最低(75.5%)，親緣關(guān)系相離最遠(yuǎn)，與其他物種的同源性如圖所示依次為狗(88.9%)、豬(90.7%)、雞(79.0%)、馬(90.6%)、鴨(76.8%)、溝鼠(85.3%)、龜(78.2%)。其結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果一致，該基因在物種之間相對保守和符合物種進(jìn)化的原則。

注：圖a中1為山羊，2為牛，3為狗，4為豬，5為雞，6為鱒魚，7為馬，8為鴨，9為溝鼠，10為龜；左下為核苷酸序列散度(分歧)結(jié)果，右上為核苷酸序列同源性結(jié)果。圖7 貴州白山羊PRDM16核苷酸序列同源性比較及進(jìn)化樹分析

2.9 互作蛋白預(yù)測

利用在線系統(tǒng)STRING檢索10個可能與山羊PRDM16蛋白的互作蛋白，結(jié)果表明，篩選出的10個相互蛋白中，與其作用性最好的是KDM1A、ZNF516和PPARG蛋白，見圖8。

圖8 PRDM16蛋白的互作蛋白預(yù)測

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，PRDM16在棕色脂肪組織細(xì)胞發(fā)育過程中起著正向調(diào)控作用，促進(jìn)棕色脂肪組織細(xì)胞中一些活性蛋白，如PPARγ、adiponectin、Cidea、UCP1等的特異性基因表達(dá)，使得白色脂肪組織細(xì)胞中一些活性蛋白，如psatl、serpin3ak和resistin等的特異性基因的表達(dá)被抑制，在白色脂肪中能使棕色脂肪相關(guān)特異性基因的表達(dá)被激活[6]。有研究表明，PRDM16基因主要在棕色脂肪細(xì)胞大量表達(dá)，可以增強(qiáng)該類細(xì)胞功能[7]。棕色脂肪細(xì)胞經(jīng)增強(qiáng)氧化作用以熱量的形式散失，從而具有潛在對抗肥胖的作用[8]。PRDM16基因則可能影響棕色脂肪細(xì)胞分化[9]。因此，PRDM16基因可作為調(diào)控動物機(jī)體生長性狀的一個重要候選基因進(jìn)行研究。

貴州白山羊是有利于發(fā)展貴州畜牧業(yè)的重要種質(zhì)資源之一。而研究表明，PRDM16在畜禽動物的生產(chǎn)性能方面存在一定的影響，在不同內(nèi)分泌及營養(yǎng)條件下存在著一定的調(diào)控作用，存在能量代謝和肌肉脂肪分化方向的生物學(xué)作用，并且調(diào)控骨骼肌以及脂肪的形成[10]，推測這可能與本研究所得該基因所編碼蛋白的氨基酸組成有一定聯(lián)系。目前在畜禽上關(guān)于PRDM16基因的研究還相對較少，僅發(fā)現(xiàn)PRDM16基因多態(tài)性與不同品種牛、山羊等的生產(chǎn)性能存在一定相關(guān)性，并且這可能與本研究中牛和山羊同源性較高的結(jié)果有關(guān)。PRDM16、CIDE-B蛋白表達(dá)和成人肥胖存在一定的聯(lián)系，體重正常者的PRDM16蛋白表達(dá)量較超重肥胖者的高(皮下脂肪組織中)[11]，本研究也發(fā)現(xiàn)PRDM16、CIDE蛋白存在互相作用有一定相關(guān)性。綜上所述PRDM16基因可作為改良貴州白山羊生長性狀的一個重要候選基因進(jìn)行深入挖掘。

4 結(jié)論

貴州白山羊PRDM16基因序列在g.342處存在G/A突變，該基因CDS區(qū)長3814bp，共編碼1271個氨基酸，為酸性不穩(wěn)定蛋白，表現(xiàn)為親水性；無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽區(qū)域；共有有141個磷酸位點(diǎn)，二級、三級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主；同源關(guān)系表明山羊與牛親緣關(guān)系最近，與鱒魚最遠(yuǎn)；其與KDM1A、ZNF516和PPARG蛋白等作用性是最好的。本研究為進(jìn)一步分析貴州白山羊PRDM16基因?qū)ι窖虻慕?jīng)濟(jì)性狀影響研究提供一定的理論依據(jù)。