多發性骨髓瘤患者骨髓活檢塑料包埋切片中血管內皮生長因子表達情況

謝訓祿

贛州市人民醫院 （江西贛州 341000）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為血液科常見疾病，屬惡性漿細胞病，起病緩慢，早期無明顯臨床癥狀，隨病情進展，逐漸出現多樣化臨床癥狀，包括腎功能不全、貧血、感染、骨痛、神經癥狀、淀粉樣變等，威脅患者生命安全，需盡早診斷治療，以延長患者生存期[1]。近年來臨床對惡性腫瘤發生發展研究增加，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）逐漸成為研究熱點[2]。有研究發現，MM 發生發展過程與VEGF 誘發的血管新生有關，即VEGF 水平升高會提升腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD），進而增加腫瘤細胞增殖速度及臨床治療難度，因此，MM 患者VEGF 水平可為評估患者疾病程度及預后提供更全面參考依據[3]。在VEGF 檢測樣本選擇中，骨髓塑料包埋切片能夠保證組織結構完整，以及VEGF 和MVD 檢測的準確性。為此，選取我院2020 年1 月至2021 年12 月期間收治的37 例MM 患者作為研究對象，分析不同分期、不同治療效果MM 患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF、MVD 水平，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2020 年1 月至2021 年12 月期間收治的37 例MM 患者，將其設為觀察組，另選取我院同期收治的40 例骨外科（非惡性腫瘤疾病）或血液病患者，將其設為對照組。觀察組男20 例，女17 例；年齡45～76 歲，平均（62.31±3.15）歲。對照組男22 例，女18 例；年齡42～75 歲，平均（63.02±4.28）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準（審批號：195132）。

納入標準：觀察組均符合《中國多發性骨髓瘤診治指南（2015 年修訂）》[4]中MM 診斷標準；所取骨髓樣本理想，可完成骨髓活檢塑料包埋切片；無精神性疾病，可配合完成本研究；對本研究知情同意。排除標準：合并其他血液系統疾病；合并其他惡性腫瘤、惡性腫瘤骨轉移；觀察組預期生存期＜4 個月；觀察組治療期間失訪。

1.2 方法

取兩組骨髓樣本，均進行骨髓活檢塑料包埋切片：局部麻醉，以B65-01 型骨髓活檢穿刺針，在髂后或髂前上棘以二步法取骨髓樣本；將骨髓樣本放在Bouin 液（5 ml 冰醋酸、20 ml 40%甲醛、75 ml 飽和苦味酸水溶液混合后避光保存）中，在快速組織處理儀（瑞沃德，型號：DSC-400）中處理5 min（處理溫度為30 ℃）；取出骨髓樣本，以30 ℃自來水浸泡、沖洗至水無色；以乙醇梯度（75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇）脫水，將骨髓樣本放在快速組織處理儀中處理5 min（處理溫度為56 ℃）；將骨髓樣本依次放入塑料包埋劑甲液（7.2 g 聚乙二醇、100 ml 甲基丙烯酸羥乙基酯單體、0.72 g 過氧化苯甲酰混合后4 ℃保存，2 ～4 h）；將裝有骨髓樣本的塑料包埋劑甲液放在包埋盒中，包埋盒中加入1/40 塑料包埋劑乙液（1 ml N，N二甲基苯甲胺、15 ml PEG-400混合后4 ℃保存），充分混勻，4 ℃保存，自然聚合后取出；常規切片、裱片、烤片，制成2 μm厚切片，實施H-Giemas-E染色。

觀察組實施化療：給予100 mg/d 沙利度胺（常州制藥廠有限公司，國藥準字H32026130，50 mg/片）+0.5 mg/d 長春新堿（深圳萬樂藥業有限公司，國藥準字H44021772，規格：1 mg/支）（d1～d4）+10 mg/（m2·d）阿霉素（Pharmacia Italia S.p.A.，H20030674，規格：10 mg/支）（d1～d4）+40 mg/d地塞米松（成都天臺山制藥有限公司，國藥準字H5102-0513，規格：0.5 ml∶2.5 mg）（d1～d4、d8～d11），4 周為1 個療程，持續治療4 個療程。

1.3 觀察指標

（1）比較兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平，VEGF，存在玫紅色顆粒樣著色為陽性，染色均勻區域內取10 個高倍鏡視野（400×），記錄100 個細胞中陽性細胞數量，即為VEGF 陽性在100 個細胞中所占百分比（正常值為0）；MVD，骨髓活檢塑料包埋切片在低倍鏡（100×）下掃視，被CD34 染成棕黃色的內皮細胞簇即計為1 個微血管，在400×視野下選擇5 個視野（代表骨髓切片面積約1.0 mm2），統計微血管數，重復計數3 次后取平均值，即為MVD 水平。（2）以國際分期體系（International staging system，ISS）對觀察組分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期），比較不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平。（3）觀察組治療4 個療程后，以《中國多發性骨髓瘤診治指南（2015 年修訂）》[4]中療效標準評價治療效果，治療效果包括完全緩解（完全緩解患者、嚴格意義的完全緩解患者、免疫表型完全緩解患者、分子學完全緩解患者）、部分緩解（部分緩解患者、非常好的部分緩解患者、微小緩解患者）、疾病穩定、疾病進展，根據治療效果計算治療有效率[治療有效率=（完全緩解例數+部分緩解例數）/總例數×100%]，并以不同治療效果分組（完全緩解組、部分緩解組、疾病穩定組、疾病進展組），均進行骨髓活檢塑料包埋切片，比較4 組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF陽性率、MVD水平。（4）分析骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期、預后相關性。

1.4 統計學處理

采用SPSS 24.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較

觀察組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平均較對照組高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

表1 兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

注：VEGF 為血管內皮生長因子，MVD 為腫瘤微血管密度

組別 例數 VEGF（%）MVD（mm2）對照組 40 15.12±5.26 9.20±1.36觀察組 37 84.39±10.20 25.63±3.64 t 37.865 26.621 P＜0.001 ＜0.001

2.2 觀察組不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 觀察組不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

表2 觀察組不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

注：VEGF 為血管內皮生長因子，MVD 為腫瘤微血管密度

分期 例數 VEGF（%）MVD（mm2）Ⅰ期 15 37.84±6.96 15.69±3.31Ⅱ期 13 90.47±15.48 24.26±5.97Ⅲ期 9 136.25±24.71 41.76±4.51 F 113.947 87.658 P＜0.001 ＜0.001

2.3 觀察組治療有效率及不同治療效果組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較

治療4 個療程后，觀察組治療有效率為75.68%（28/37）。完全緩解組、部分緩解組、疾病穩定組、疾病進展組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 觀察組不同治療效果組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

表3 觀察組不同治療效果組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

注：VEGF 為血管內皮生長因子，MVD 為腫瘤微血管密度

組別 例數 VEGF（%）MVD（mm2）完全緩解組 12 20.34±3.63 13.25±2.31部分緩解組 16 31.47±4.00 16.84±3.14疾病穩定組 6 35.58±3.57 20.34±3.58疾病進展組 3 48.39±9.19 25.30±4.07 F 62.103 49.440 P＜0.001 ＜0.001

2.4 骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期、預后相關性分析

骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD水平與MM 患者疾病分期（Ⅰ～Ⅲ期）、預后（完全緩解及疾病進展）呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期、預后相關性分析

3 討論

MM 在臨床較為常見，早期疾病診斷中，其血清學指標、病理組織改變不顯著，易與慢性結核感染、慢性肝病等慢性疾病及淋巴瘤等疾病混淆。腫瘤組織細胞增殖分裂速度快，對血運要求較高，會刺激病灶組織內VEGF 水平快速升高，以促進腫瘤內部快速形成大量新生血管，為腫瘤增殖分裂提供血運基礎[5]。同時在腫瘤細胞代謝、浸潤轉移過程中，同樣依賴新生的腫瘤血管網，促進贅生性漿細胞增殖及骨髓血管生成[6]。而VEGF 水平升高，會使腫瘤內部出現大量新生血管，因此MVD 水平隨之升高[7]。

與血清VEGF 水平相比，病灶內VEGF 水平可更真實地反映病灶狀態。與傳統石蠟包埋相比，骨髓活檢塑料包埋的樣本無需經過脫鈣處理，不易引發細胞收縮，細胞結構完整性良好，且對組織中酶活性保存良好，酶化學定位過程中可保證定位準確性。本研究結果顯示，觀察組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平均較對照組高，差異有統計學意義（P＜0.05）；考慮原因為，MM 患者骨髓組織中惡性腫瘤生長、增殖、代謝過程中需要大量血運支持，會使血管生成水平上調，因此會出現VEGF 陽性率、MVD 水平升高情況。劉小敏等[8]研究發現，MM 患者疾病發展過程中，miR-129-5p 可靶向負調控MM 患者BDNF、VEGF陽性率表達，而若miR-129-5p 調控能力下降，則會出現VEGF 表達水平上升情況，可能為MM 患者疾病進展主要原因之一。

本研究結果還顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；說明MM患者骨髓組織中VEGF 陽性率、MVD 水平升高，疾病分期隨之升高[9-10]。因此，在臨床評估MM 嚴重程度中，若骨髓組織中VEGF 呈現高表達水平，則提示患者病情相對嚴重。

本研究結果顯示，治療4 個療程后，觀察組治療有效率為75.68%，完全緩解組、部分緩解組、疾病穩定組、疾病進展組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期（Ⅰ～Ⅲ期）、預后（完全緩解及疾病進展）呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.05）。其原因為，在對MM 患者臨床治療中，抑制VEGF 生成為主要治療方案，沙利度胺具抗炎、調節免疫、抑制血管生成的作用，對VEGF 表達具有抑制作用；長春新堿、阿霉素均為作用于細胞周期的治療藥物，可抑制腫瘤細胞增殖分裂，抑制對VEGF 需求，進而可抑制VEGF 表達，因此在治療后會出現VEGF 陽性率、MVD 水平下降情況；但部分患者在治療期間受自身免疫能力、化療耐藥等情況影響，可能會出現VEGF 抑制作用不足等情況，影響病情控制效果[11-12]。因此，在MM 患者化療過程中，若出現VEGF 下降速度緩慢或升高情況，則提示疾病控制不良，需積極開展相關檢查，并更換治療藥物，以提升治療效果、改善預后。

綜上所述，MM 患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平顯著提升，且疾病分期越高，骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD水平越高；MM 患者接受治療后，骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平下降，提示預后良好，可用于輔助疾病診斷及治療效果評估。