跨膜蛋白41B 在肝細胞肝癌組織中的表達及其對患者預后的影響

辜國軍，秦易，胡萌宇

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第四大惡性腫瘤，同時，也是全球第三大癌癥死亡原因［1］。HCC 發病隱匿，早期較難被發覺，多數患者就診時已為中晚期，因此，死亡率一直居高不下［2］。近年來，針對HCC 的治療手段越來越多，如射頻消融術、經肝動脈化療栓塞及靶向藥物治療等，均取得了較好的治療效果，但仍有部分HCC 患者術后復發、轉移或死亡，預后較差［3］，因此，早期了解預后情況并及時給予有效的治療具有重要意義。CT 或MRI 等影像學檢查可明顯觀察到HCC 病灶大小和邊緣強化情況，在評估腫瘤病灶控制方面有較高的價值，但對于評估預后的價值較低。因此，急需探尋價值較高的指標用于HCC 預后評估。

自噬在HCC 發展過程中發揮著重要作用，其可調節癌細胞的凋亡、耐藥等［4］。跨膜蛋白41B（TMEM41B）是一種細胞自噬調節蛋白，在自噬小體的形成過程中起著關鍵作用［5-8］，其與泡膜蛋白1 在結構和功能上具有相似之處［9］。泡膜蛋白1 可通過調節癌細胞的轉移和增殖影響HCC 預后［10］。基于上述研究，有理由認為TMEM41B 與HCC 有關，是評估HCC 預后的潛在生物標志物。目前，少有研究分析TMEM41B 與HCC 預后的關系，本研究主要分析TMEM41B 在HCC 組織中的表達及其對患者預后的影響，以期為HCC 的預后評估提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016 年3 月至2018 年3 月在眉山市第二人民醫院就診的164 例HCC 患者作為研究對象，男性106 例，女性58 例；年齡48～70 歲［（62.18 ±4.66）歲］；乙肝表面抗原（HBsAg）陽性135 例；Child-Pugh A 級123 例，B 級41 例；腫瘤直徑＞5 cm 79 例；腫瘤單發62 例，多發102 例；甲胎蛋白（AFP）＞400 μg/L 96 例；血管侵犯79 例；腫瘤分期Ⅰ期15 例，Ⅱ期70 例，Ⅲ期79 例。參照《原發性肝癌診療規范》［11］診斷HCC。納入標準：（1）病理活檢確診為HCC；（2）臨床資料完整。排除標準：（1）隨訪失聯；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）肝、腎功能嚴重異常；（4）有自身免疫性疾病史或血液系統疾病史等；（5）獲取HCC 組織前接受放、化療、生物治療或靶向治療等。本研究所有受試者均知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經眉山市第二人民醫院醫學倫理委員會批準［倫理批號：2022 年審（05）號］。

1.2 TMEM41B 表達量檢測

用蛋白質免疫印跡法［12］檢測TMEM41B 表達量。取凍存的穿刺或手術獲取的HCC 組織和癌旁組織，解凍后剪碎，用TL2020 型組織研磨儀［鼎昊源（天津）生物科技有限公司］研磨，獲取組織勻漿。用RIPA 裂解液裂解組織細胞，4 ℃下4 000 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm，提取離心后上清液。BCA 法對蛋白進行定量。80 V 凝膠電泳15 min，然后加壓至120 V，直至溴酚藍跑出膠面；300 mA 60 min 進行轉膜；5% 脫脂牛奶搖床孵育1 h；滴加兔抗人TMEM41B 多克隆抗體（臺灣亞諾法生技股份有限公司，批號：PAB20785），4 ℃下孵育過夜；滴加山羊抗兔二抗（臺灣亞諾法生技股份有限公司，批號：PAB10828），搖床孵育1 h；ECL 發光液顯影。用Image J 1.8.0 軟件分析凝膠圖像。

1.3 隨訪

于受試者出院后1 個月隨訪，之后每3～6 個月隨訪1 次，共隨訪3 年，末次隨訪時間為2021 年4 月，隨訪終點為至隨訪結束或死亡。隨訪6～36 個月，111 例HCC 患者存活（生存組），53 例死亡（死亡組）。

1.4 統計學處理

用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。正態分布的計量資料以±s表示，組內比較采用配對樣本t檢驗，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用F檢驗，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數資料以頻數和%表示，組間比較采用χ2檢驗。用受試者工作特征（ROC）曲線評價TMEM41B 診斷HCC 預后的效能。用Cox 回歸分析HCC 預后的風險因素。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMEM41B 在HCC 組織和癌旁組織中的表達

HCC 組織中TMEM41B 表達量0.36 ± 0.06 高于癌旁組織0.21 ± 0.05，差異有統計學意義（t=25.087，P＜0.001）。見圖1。

圖1 TMEM41B 在HCC 組織和癌旁組織中的表達

2.2 TMEM41B 與HCC 患者的一般資料和臨床病理參數的關系

不同年齡、性別、HBsAg、Child-Pugh 分級、腫瘤數目和AFP 的HCC 患者的TMEM41B 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。腫瘤直徑＞5 cm 的HCC 患者TMEM41B 相對表達量高于腫瘤直徑≤5 cm 的HCC 患者，血管侵犯的HCC 患者TMEM41B 相對表達量高于未侵犯血管的HCC 患者，腫瘤分期Ⅲa 期的HCC 患者TMEM41B 相對表達量高于Ⅰ期的HCC 患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 TMEM41B 與HCC 患者的一般資料和臨床病理參數的關系

2.3 TMEM41B 與HCC 預后的關系

生存組的TMEM41B 相對表達量（0.34 ± 0.05）低于死亡組（0.40 ± 0.07），差異有統計學意義（t=4.534，P＜0.001）。TMEM41B 診 斷HCC 預 后 的ROC 曲線下面積、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.716（95%CI：0.631～0.801）、0.34、75.47%和60.36%。見圖2。

圖2 TMEM41B 診斷HCC 預后的ROC 曲線

2.4 HCC 預后的Cox 回歸分析

將HCC 預后作為因變量，將年齡、性別、HBsAg、Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、腫瘤數目、AFP、腫瘤分期和TMEM41B（以TMEM41B 診斷HCC 預后的ROC 曲線最佳截斷點為界值將其轉換為二分類變量）作為自變量，分別納入Cox 回歸分析，結果顯示Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、AFP、腫瘤分期和TMEM41B 與HCC 預后有關（P＜0.05）。將HCC 預后作為因變量，將Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、AFP、腫瘤分期和TMEM41B 作為自變量，一并納入Cox回歸分析，結果顯示Child-Pugh B 級、腫瘤直徑＞5 cm、腫瘤分期和TMEM41B＞0.34 是HCC 預后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3、4。

表3 HCC 預后風險因素的Cox 多因素分析結果

表3 HCC 預后風險因素的Cox 單因素分析結果

3 討論

自噬是一種真核細胞特有的代謝方式，其可清除胞質內受損的細胞器及活性氧物質等，用于維持細胞內穩態和DNA 的穩定［13］。正常條件下，細胞的自噬活動處于較低水平，當受到細胞因子、缺氧、缺營養物質等刺激時，自噬增強［14］。HCC 細胞自噬與其凋亡、治療敏感度密切相關［15-16］。TMEM41B 表達降低可抑制自噬體的生物合成，從而干擾細胞自噬［5-8］。目前，TMEM41B 已被報道與骨肉瘤［17］和肺癌［18］的發生發展相關，但關于其與HCC 的關系鮮有研究報道。本研究主要分析TMEM41B 在HCC 組織中的表達及對患者預后的影響，以期為HCC 的預后評估提供參考依據。

本研究結果顯示HCC 組織中TMEM41B 相對表達量高于癌旁組織，該結果提示TMEM41B 與HCC發病和進展有關，是HCC 預后的潛在生物標志物。本研究分析不同HCC 病理參數的TMEM41B 相對表達量，結果顯示腫瘤直徑＞5 cm 的HCC 患者TMEM41B 相對表達量高于腫瘤直徑≤5 cm 的HCC患者。該結果提示TMEM14B 可能通過調控腫瘤大小影響HCC 預后。推測其原因是HCC 細胞繁殖迅速，需要大量物質供能。HCC 細胞中TMEM41B 的表達上調可促進細胞自噬，進而為其增殖提供能量，故TMEM41B 表達量越高，腫瘤病灶可能越大。血管侵犯的HCC 患者TMEM41B 相對表達量高于未侵犯血管的HCC 患者，該結果提示TMEM14B 可能通過促進血管侵犯影響HCC 預后。推測其原因是TMEM41B 表達上調可促進HCC 細胞自噬，從而為其血管侵犯供能，故存在血管侵犯的患者，其癌組織中TMEM41B 表達上調。腫瘤分期Ⅲa 期的HCC患者TMEM41B 相對表達量高于Ⅰ期的HCC 患者，推測其原因是腫瘤病灶和血管侵犯與腫瘤分期密切相關，TMEM41B 表達上調可增加腫瘤病灶大小并促進血管侵犯，故腫瘤分期Ⅲa 期的TMEM41B 相對表達量更高。

本研究中164 例HCC 患者3 年生存率為67.68%，與王鶴等［19］結果（66.7%）接近。本研究比較了生存組和死亡組的TMEM41B 相對表達量，結果顯示生存組的TMEM41B 相對表達量低于死亡組，該結果證實TMEM41B 與HCC 預后有關，或可成為評價HCC 預后的生物標志物。本研究進一步構建了TMEM41B 診斷HCC 預后的ROC 曲線，結果顯示其診斷HCC 預后的ROC 曲線下面積、靈敏度和特異度分別為0.716、75.47%和60.36%，該結果提示TMEM41B 對HCC 預后評價有一定價值，尚可輔助用于臨床醫師評估HCC 預后。

本研究用Cox 回歸分析了HCC 預后的風險因素，結果顯示TMEM41B＞0.34 是HCC 預后的獨立危險因素，推測其原因可能有以下2 點：（1）TMEM41B 通過調節HCC 細胞自噬使其免于凋亡；（2）TMEM41B 通過調節HCC 細胞自噬使其避免化療藥物、靶向藥物誘發的損傷，從而影響HCC 預后。HCC 組織中TMEM41B 表達量可反映HCC 細胞的自噬程度，進而反映HCC 預后，其病理生理機制仍有待開展基礎研究進一步證實。此外，本研究結果還顯示Child-Pugh B 級、腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高是HCC 預后的獨立危險因素，與既往報道［20-21］結果一致。

綜上所述，HCC 組織中TMEM41B 表達與腫瘤直徑、血管侵犯和腫瘤分期有關。HCC 組織中TMEM41B 表達量高提示HCC 預后不良。本研究尚存在一定不足，一是樣本量偏小，樣本選擇上可能存在一定選擇偏倚，還需開展大樣本、多中心研究進一步分析TMEM41B 與HCC 預后的關系；二是未開展基礎研究分析TMEM41B 參與HCC 發病和進展的病理生理機制，下一步將針對上述不足進行補充，以充實本研究結論。