免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測對下呼吸道感染患兒肺炎支原體感染的診斷價值分析

曲奎堯，張珊，謝春艷，董彥茂，張傳倉

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童呼吸道感染的重要病原體之一。MP 感染常見于學齡前期及學齡期兒童，近年來嬰幼兒感染亦有不少報道［1-2］。MP 感染的臨床表現不典型，缺少特異性，僅依據臨床表現難與其他病原體引起的呼吸道感染相鑒別。加之自2000 年以來研究表明大環內酯類耐藥MP 的證據越來越多［3］，因此，快速有效的實驗室診斷尤為重要。本研究回顧性分析在海軍第九七一醫院兒科住院當天利用免疫膠體金法（immune colloidal gold technique，GICT）與住院次日利用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）同時行MP-IgM 抗體檢測的下呼吸道感染患兒的臨床資料，評價2 種檢測方法對MP 感染的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年1-12 月在海軍第九七一醫院住院的985 例下呼吸道感染患兒的臨床資料。985 例患兒中，男515 例，女470 例，男∶女=1.1∶1，年齡1 個月～14 歲；其中支氣管肺炎390 例，普通肺炎572 例，大葉性肺炎23 例。選取入院當天在醫院門診利用GICT 并在入院次日利用IFA 行MP-IgM 檢測且發病病程均≥4 d 的134 例患兒的臨床資料。其中支氣管肺炎25 例，普通肺炎100 例，大葉性肺炎9 例。根據患兒年齡將其分為＜3 歲組、3～6 歲組、＞6 歲組。根據患兒發病病程將其分為4～7 d 組和＞7 d 組。

1.2 方法

1.2.1 GICT 采用北京貝爾生物工程有限公司生產的MP-IgM 檢測試劑盒進行檢測。取入院當天門診下呼吸道感染患兒末梢血20 μl 進行檢測。嚴格按照說明書進行操作，15～20 min 判斷結果。對照線和檢測線均出現為陽性；只顯示對照線為陰性；對照線不顯示及超過20 min 判斷結果無效。

1.2.2 IFA 采用西班牙Vircell 公司生產的9 項呼吸道感染病原體IgM 抗體檢測試劑盒。入院次日清晨患兒空腹抽取靜脈血3 ml 進行檢測，檢測方法及質控要求嚴格按說明書進行。用免疫熒光顯微鏡觀察結果，以效價＞1∶16 為陽性。

1.3 臨床MP 感染診斷

根據患兒臨床癥狀（以咳嗽和/或發熱為最主要癥狀）、體征（肺部體征輕與發熱、劇咳不一致）、影像學檢查（X 線改變明顯而肺部體征輕）及大環內酯類抗生素治療有效等臨床特點，由2 名具有主治醫師以上職稱的兒科醫生共同得出臨床MP 感染的診斷結論。臨床符合率即診斷試驗結果與受試者實際情況相符合的概率=［（陽性符合例數+陰性符合例數）/總例數］×100%。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析。計數資料以百分比（%）表示，配對資料的差異性采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

134 例下呼吸道感染患兒中，男63 例，女71 例，年齡6 個月～11 歲，男∶女=0.88∶1。年齡＜3 歲組33 例，3～6 歲組63 例，＞6 歲組38 例。入院前病程4～7 d 組76 例，＞7 d 組58 例。134 例下呼吸道感染患兒中符合臨床MP 感染診斷107 例。

2.2 2 種方法MP 檢測陽性率比較

134 例下呼吸道感染患兒中，GICT 的MP 檢測陽性例數為62 例（46.3%），IFA 為99 例（73.9%），2 種方法MP 檢測陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測134 例下呼吸道感染患兒MP 結果比較［例（%）］

2.3 2 種方法檢測不同年齡組、不同病程組MP 陽性率比較

GICT 和IFA 在年齡＜3 歲組、3～6 歲組、＞6 歲組MP 檢測陽性率比較差異無統計學意義（χ2=5.983，P=0.050；χ2=0.403，P=0.818）。見表2。而在4～7 d 組和＞7 d 組的不同病程組中，GICT 對MP檢測陽性率分別為34.2%、58.6%，差異有統計學意義（χ2=7.927，P=0.005）；IFA 對MP 感染檢測陽性率分別為65.8%、84.5%，差異有統計學意義（χ2=5.957，P=0.015）。見表3。

表2 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測不同年齡組患兒MP 感染陽性率比較［例（%）］

表3 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測對不同病程組患兒檢測MP 感染陽性率比較［例（%）］

2.4 2 種方法檢測MP 感染臨床符合率比較

利用GICT 檢出MP 感染陽性例數62 例，陰性例數72 例，其中陽性診斷符合的54 例，陰性診斷符合的19 例，共73 例符合臨床診斷，符合率為54.5%；IFA 檢出MP 感染陽性例數99 例，其中陽性診斷符合的90 例，陰性診斷符合的18 例，共108 例符合臨床診斷，符合率為80.6%；2 種方法臨床符合率比較差異有統計學意義（χ2=21.927，P＜0.01）。見表4。同時，在不同病程組之間對MP 感染臨床符合率比較分析，4～7 d 組76 例，2 種檢測方法對MP 感染檢出均陽性17 例，其中符合臨床MP 感染15 例，不符合2 例，陽性符合率88.2%；2 種檢測方法對MP 感染檢出均陰性15 例，其中臨床陽性診斷7 例，符合臨床陰性診斷8 例，陰性符合率為53.3%。＞7 d 組58 例，2 種檢測方法均陽性30 例，均符合臨床支原體感染陽性診斷，陽性符合率100%；2 種檢測方法均陰性5 例，4 例符合臨床支原體陰性診斷，陰性符合率為80.0%。見表5。

表4 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測MP 感染臨床符合率比較（例）

表5 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測均陽性、均陰性在不同病程組間對MP 感染臨床診斷情況比較（例）

3 討論

MP 屬柔膜體綱，支原體屬，是一類無細胞壁、呈多形性、能夠自我復制、不依靠活體細胞而生存的最小微生物［4］。由于缺乏細胞壁，因此對作用于細胞壁的抗菌藥物具有耐藥性［3］。MP 呼吸道感染的致病機制主要通過粘附及細胞毒效應對呼吸道上皮直接損傷和免疫機制引起呼吸道及肺外損傷［5-6］。MP 是兒童呼吸道感染的重要病原體，經飛沫和直接接觸傳播，潛伏期l～3 周，潛伏期內至癥狀緩解數周均有傳染性。MP 呼吸道感染臨床表現呈多樣性，可以從無癥狀到鼻咽炎、鼻竇炎、中耳炎、咽扁桃體炎、氣管支氣管炎和肺炎等［7］。MP 肺炎發生率約是普通肺炎的20 倍，而10%～40% 的MP 呼吸道感染會發展成肺炎［7-8］。目前MP 是我國社區獲得性肺炎的主要病原體，約占小兒肺炎的10%～20%。MP 肺炎主要臨床表現為發熱和咳嗽，發熱程度不一，可表現為高熱、中等度熱或低熱，甚至無熱。咳嗽主要為刺激性干咳，個別患兒會出現類百日咳樣咳嗽。MP 肺炎可導致肺外并發癥，幾乎可以累及全身各個系統，如皮膚黏膜系統、神經系統、心血管系統、消化系統、血液系統、泌尿系統等，發生率約25.0%。目前大環內酯類抗生素仍為兒童MP 感染的首先用藥，但自2001 年日本學者首次發現大環內酯類抗生素耐藥的MP（macrolide-resistant MP，MRMP）報道后［9］，中國、歐洲及美國相繼分離出MRMP 菌株。由于大環內酯類抗生素在兒童中的單一、過度及不規范用藥，目前世界各國MRMP 急劇增加，尤其在東亞國家耐藥率更高［10］。日本有研究顯示2015 年MP 的耐藥率為43.6%［11］。2008-2012 年連續5 年監測北京MP 的耐藥率分別為68.9%、90.0%、98.4%、95.4%、97.0%［12］。鑒于上述特點，急需研究能夠及時準確地判斷MP 感染的實驗室診斷方法。兒童MP 感染的實驗室診斷方法包括MP 病原體培養、MP 核酸檢測、MP 抗原直接檢測、MP 血清抗體檢測。其中，MP 培養陽性是判斷MP 感染的“金標準”，但由于對培養環境要求苛刻且培養周期長，對臨床早期診斷意義不大。MP核酸檢測包括DNA 和RNA 檢測，具有靈敏度高、檢測速度較快的特點，但特異性相對不足，不能區分其是由機體自身攜帶還是現行感染，且對標本保存及采集人員標準要求較高［13-14］。MP 抗原直接檢測特異性較高，但靈敏度低。由于MP 感染患者的咽拭子病原體含量一般為1×105～1×106CFU/L，而該方法最小檢測含量一般為1×106CFU/L，故易引起假陰性［15］。MP 血清抗體檢測由于方法簡單，臨床應用較廣，常用方法有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、顆粒凝集法（PA）、GICT、化學發光法（CLIA）、IFA。MP 感染機體后，體內可產生特異性的IgM 抗體，IgM 抗體一般在感染后4～5 d 出現，3～4 周后達高峰，持續1～3 個月甚至半年以上，可作為近期感染的診斷指標［7,16］。GICT 檢測簡便，可用末梢全血，所需血量少，出具結果迅速，適合門診或急診患兒疑似MP 感染的快速篩查［7］。IFA 需靜脈血，出具結果相對較慢，該方法多應用于住院兒童。在臨床診治過程中發現，住院兒童中2 種方法檢測結果既存在一致性又有差異，為了探討2 種方法的臨床，本研究回顧性分析2019 年在海軍第九七一醫院住院的下呼吸道感染患兒的臨床資料。鑒于MP 產生抗體的時間，本研究在篩選病例時剔除了發病病程＜4 d 的病例。在符合條件的134 例下呼吸道感染患兒中，2 種檢測方法均陽性47 例，均陰性20 例。其中GICT 檢出MP 感染陽性例數62 例，檢測陽性率為46.3%，73 例符合臨床診斷，符合率54.5%；IFA 檢出MP 感染陽性例數99 例，檢測陽性率為73.9%，108 例符合臨床診斷，符合率80.6%；經統計分析2 種方法對MP 檢測陽性率及臨床符合率均差異有統計學意義。雖然2 種方法在不同年齡組對MP 檢測陽性率差異無統計學意義，但2 種檢測方法均隨著患兒年齡段的增加而檢出陽性率升高，尤其在＞6 歲組檢出陽性率最高，這與臨床中MP 感染主要發生在學齡期兒童一致。通過在不同病程組比較分析發現，2 種方法均在病程4～7 d 的患兒MP 感染檢測陽性率較低，2 種檢測方法均陽性與MP 臨床診斷陽性符合率為88.2%，但陰性符合率僅為53.3%；而在病程超過7 d 的患兒MP 感染檢出率更高，且2 種檢測方法均陽性與臨床MP 感染判斷完全符合，陽性符合率100%，同時陰性符合率為80.0%。因此，對病程超過7 d 的患兒，2 種檢測方法聯合使用可為臨床判斷提供重要決策，而對病程4～7 d 的患兒僅單獨采用血清特異性IgM 抗體方法判斷有無MP 感染仍需謹慎，需要結合臨床綜合判斷或聯合其他實驗室檢測方法。鑒于國內MP檢測的試劑盒廠家眾多，每種方法的敏感性和特異性不同，中華醫學會兒科分會臨床檢驗學組建議有條件的實驗室至少開展2 種以上的檢測方法來相互彌補之不足［13］。李少麗等［17］認為，臨床上不能通過單份血清抗體檢測陽性來確診MP 感染，建議采用血清法和PCR 聯合檢測。另外，本研究中對于GICT 檢測陽性率低的結果考慮存在以下原因：不同公司生產的試劑盒的質量會對結果造成一定影響；該研究中運用GITC 采血的時間相對IFA 要提前約1 d，抗體產生的量相對少。

本研究發現，雖然在不同年齡段2 種方法對MP 檢測陽性率無差異，但在小年齡組，2 種方法的檢測陽性率均最低，考慮原因是由于小年齡組免疫功能不完善，機體產生抗體能力較弱。根據上述特點，2019 年中華醫學會兒科分會臨床檢驗學組專家共識提出，根據患者現在和既往的癥狀、門診和住院、篩查和確診等不同的感染情況選擇不同的檢測方法，為臨床MP 感染的診斷提供合理、經濟、高效的參考建議。此外，中國兒童MP 感染實驗室診斷規范和臨床實踐專家共識（2019 年）提出可根據患兒年齡、免疫功能狀態、病程及就診醫院等級對MP感染提出分層推薦的實驗室診斷方法。

本研究發現，IFA 較GICT 對MP 感染的檢測陽性率及臨床符合率均更高，且二者之間差異有統計學意義。2 種方法在不同年齡組對MP 感染檢測陽性率無差異，但隨著患兒年齡增加，陽性率均升高。在不同病程組2 種方法對MP 檢測陽性率均差異有統計學意義，且對發病病程超過7 d 的患兒檢測陽性率更高，二者聯合檢測均陽性與臨床MP 感染陽性判斷完全符合。對于病程4～7 d 的患兒仍需結合臨床或聯合其他實驗室診斷方法進行判斷。