miR-335 通過調(diào)控鐵死亡對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用及機制研究

袁莉，向軍軍，李麗琴，陳煒，胡躍強，姚春

缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是全球范圍內(nèi)發(fā)病率高、死亡率高的常見疾病之一［1］，是由血栓形成或栓塞導(dǎo)致血流突然中斷并阻塞供應(yīng)大腦特定區(qū)域血管引起的病癥［2］。目前，溶栓治療是IS的主要治療方式之一，但其治療時間窗較窄。近年研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡可通過影響鐵自噬或鐵代謝而在IS的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［3］。當(dāng)腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷時，自噬途徑被激活并誘導(dǎo)鐵蛋白過度降解，導(dǎo)致神經(jīng)元中的游離鐵增加，這種現(xiàn)象稱為鐵自噬，而鐵自噬過程主要受核受體共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）的調(diào)節(jié)［4］。F-box和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白5（F-box and leucine-rich repeat protein 5，F(xiàn)BXL5）是SCF型泛素連接酶的底物識別亞基，可作為哺乳動物細胞中鐵代謝的主要調(diào)節(jié)劑，其缺乏會導(dǎo)致鐵調(diào)節(jié)蛋白1的持續(xù)積累、鐵攝取調(diào)節(jié)障礙，最終導(dǎo)致鐵過載和活性氧的產(chǎn)生［5］。因此，F(xiàn)BXL5/NCOA4在大腦鐵穩(wěn)態(tài)中起重要作用。

miRNA作為非編碼RNA，是IS等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要遞質(zhì)［6］。研究表明，miR-335可參與神經(jīng)元的生長和發(fā)育，成年大鼠短暫大腦中動脈閉塞后腦組織miR-335表達降低［7］。但miR-335在大鼠腦I/R損傷中的具體調(diào)控機制尚不清楚。本研究旨在探討miR-335通過調(diào)控鐵死亡途徑對大鼠腦I/R損傷的保護作用及機制，以期為IS提供新的治療策略，最大限度地減輕腦I/R損傷后永久性腦損傷和殘疾。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2022年3—9月。

1.2 試驗動物 成年雄性Sprague Dawley大鼠180只，體質(zhì)量280～320 g，均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014。將大鼠飼養(yǎng)在受控環(huán)境中〔溫度（21±2）℃，相對濕度（55±5）%，12 h光照/黑暗交替〕，實驗期間，所有大鼠可自由獲得食物和水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實驗程序均按照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南進行，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（批號：DW20211204-195）。

1.3 主要試劑 大鼠miR-335模擬物腺相關(guān)病毒及大鼠miR-335抑制物腺相關(guān)病毒（上海吉滿生物科技有限公司），TRIzol?試劑（Ambion公司），mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔新貝（上海）生物科技有限公司〕，彩色預(yù)染蛋白Marker、山羊抗兔IgG HRP、ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒、BCA蛋白濃度測定kit、內(nèi)參抗GAPDH抗體（Biosharp公司），抗FBXL5抗體及抗NCOA4抗體（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)）。

1.4 實驗分組及干預(yù)方法 將180只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、miR-335模擬物組、miR-335模擬物對照組、miR-335抑制物組、miR-335抑制物對照組，每組30只。假手術(shù)組大鼠僅暴露右側(cè)大腦中動脈并縫合。模型組大鼠制備大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）損傷模型，具體如下：在大鼠右側(cè)大腦中動脈做一中線頸部切口，然后定位右頸外動脈，采用大鼠硅膠線栓結(jié)扎其分支，造成大腦中動脈閉塞；大腦中動脈閉塞2 h后，拔出大鼠硅膠線栓一定長度以允許血液通過右頸內(nèi)動脈回流，造成大腦中動脈再灌注［8］。本實驗以模型制備后2 h Zea Longa評分1～3分為MCAO/R損傷模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。miR-335模擬物組大鼠在大腦中動脈腦立體定位注射miR-335模擬物腺相關(guān)病毒2 μl。腦立體定位注射方法如下：將大鼠麻醉后固定在StereoDrive立體定位系統(tǒng)框架中，取2 μl純化后的腺相關(guān)病毒并將其固定在定位儀上，將注射器針尖移至大腦中動脈標(biāo)記處并鉆孔〔其中Y軸：0 mm，X軸：-2.5 mm，Z軸：-3.5 mm（相對于前囟點和硬腦膜表面）〕，進針深度達3 mm后緩慢注射腺相關(guān)病毒；7 d后制備MCAO/R損傷模型。miR-335模擬物對照組大鼠在大腦中動脈腦立體定位注射miR-335模擬物空載體，7 d后制備MCAO/R損傷模型。miR-335抑制物組大鼠在大腦中動脈腦立體定位注射miR-335抑制物腺相關(guān)病毒2 μl，7 d后制備MCAO/R損傷模型。miR-335抑制物對照組大鼠在大腦中動脈腦立體定位注射miR-335抑制物空載體，7 d后制備MCAO/R損傷模型。于模型制備后12、24、72 h，分別在各組隨機選取10只大鼠并將其處死，取缺血半暗帶區(qū)腦組織以進行后續(xù)實驗。

1.5 Zea Longa評分 采用Zea Longa評分（5級評分法）評估各組大鼠模型制備后2、12、24、72 h神經(jīng)功能缺損程度，評分越高表明大鼠神經(jīng)功能缺損程度越嚴(yán)重［9］。

1.6 qRT-PCR 采用qRT-PCR檢測各組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織miR-335、FBXL5 mRNA、NCOA4 mRNA相對表達量。使用TRIzol?試劑從缺血半暗帶區(qū)腦組織中提取總RNA，采用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。使用擴增試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s 1個循環(huán)，變性95 ℃ 3～10 s、退火和延伸60 ℃ 10～30 s，共45個循環(huán)，融解曲線時間為儀器默認(rèn)，1個循環(huán)數(shù)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-335相對表達量；以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算FBXL5、NCOA4 mRNA相對表達量［10］。引物序列見表1。

表1 引物序列及擴增長度Table 1 Primer sequence and amplification length

1.7 Western blot法 采用Western blot法檢測各組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織FBXL5、NCOA4蛋白相對表達量。從缺血半暗帶區(qū)腦組織勻漿中提取制備的蛋白質(zhì)樣品（n=6），然后通過SDS-PAGE電泳液緩沖液分離蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；加入5%脫脂奶粉于4 ℃封閉過夜，加入一抗（1∶1 000）進行孵育；加入二抗（1∶20 000）于室溫下孵育60 min，采用TBST洗滌膜4次。使用Image J圖像分析軟件分析FBXL5、NCOA4蛋白相對表達量［11］。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zea Longa評分 本研究大鼠均建模成功。假手術(shù)組大鼠Zea Longa評分為0分。模型制備后12、24、72 h，五組大鼠Zea Longa評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型制備后12、24、72 h，miR-335模擬物組大鼠Zea Longa評分低于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠Zea Longa評分高于miR-335抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 五組大鼠模型制備后12、24、72 h Zea Longa評分比較（±s，分，n=10）Table 2 Comparison of Zea Longa scores in five groups at 12，24 and 72 h after model preparation

表2 五組大鼠模型制備后12、24、72 h Zea Longa評分比較（±s，分，n=10）Table 2 Comparison of Zea Longa scores in five groups at 12，24 and 72 h after model preparation

注：a表示與miR-335模擬物對照組比較，P＜0.05；b表示與miR-335抑制物對照組比較，P＜0.05

組別 模型制備后12 h 模型制備后24 h 模型制備后72 h模型組 2.70±0.48 2.60±0.52 2.50±0.27 miR-335模擬物組 1.70±0.61a 1.60±0.52a 1.40±0.12a miR-335模擬物對照組 2.50±0.31 2.60±0.31 2.60±0.23 miR-335抑制物組 2.90±0.22b 2.70±0.16b 2.70±0.21b miR-335抑制物對照組 2.70±0.18 2.50±0.30 2.30±0.48 F值 6.067 83.34 9.695 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 腦組織miR-335相對表達量 模型制備后12、24、72 h，六組大鼠腦組織miR-335相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型制備后12、24、72 h，模型組大鼠腦組織miR-335相對表達量低于假手術(shù)組，miR-335模擬物組大鼠腦組織miR-335 mRNA相對表達量高于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠腦組織miR-335相對表達量低于miR-335抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 六組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織miR-335相對表達量比較（±s，n=10）Table 3 Comparison of relative expression levels of miR-335 in brain tissue in six groups at 12，24 and 72 h after model preparation

表3 六組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織miR-335相對表達量比較（±s，n=10）Table 3 Comparison of relative expression levels of miR-335 in brain tissue in six groups at 12，24 and 72 h after model preparation

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與miR-335模擬物對照組比較，P＜0.05；c表示與miR-335抑制物對照組比較，P＜0.05

組別 模型制備后12 h 模型制備后24 h 模型制備后72 h假手術(shù)組 1.02±0.10 1.02±0.05 1.00±0.09模型組 0.64±0.02a 0.62±0.03a 0.84±0.21a miR-335模擬物組 2.45±0.03b 2.84±0.10b 3.21±0.27b miR-335模擬物對照組 1.03±0.01 1.08±0.01 1.04±0.03 miR-335抑制物組 0.31±0.35c 0.34±0.04c 0.45±0.17c miR-335抑制物對照組 1.02±0.01 1.05±0.01 1.03±0.02 F值 13.60 13.09 29.96 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 腦組織FBXL5、NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量

模型制備后12、24、72 h，六組大鼠腦組織FBXL5、NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型制備后12、24、72 h，模型組大鼠腦組織FBXL5 mRNA、蛋白相對表達量低于假手術(shù)組，miR-335模擬物組大鼠腦組織FBXL5 mRNA、蛋白相對表達量高于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠腦組織FBXL5 mRNA、蛋白相對表達量低于miR-335抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型制備后12、24、72 h，模型組大鼠腦組織NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量高于假手術(shù)組，miR-335模擬物組大鼠腦組織NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量低于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠腦組織NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量高于miR-335抑制物對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4～5、圖1。

圖1 六組模型制備后12、24、72 h腦組織FBXL5、NCOA4蛋白SDS-PAGE圖Figure 1 SDS-PAGE of FBXL5 and NCOA4 proteins in brain tissue of six groups at 12，24 and 72 h after model preparation

表4 六組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織FBXL5、NCOA4 mRNA相對表達量比較（±s，n=10）Table 4 Comparison of relative expression levels of FBXL5 and NCOA4 mRNA in brain tissue in six groups at 12，24 and 72 h after model preparation

表4 六組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織FBXL5、NCOA4 mRNA相對表達量比較（±s，n=10）Table 4 Comparison of relative expression levels of FBXL5 and NCOA4 mRNA in brain tissue in six groups at 12，24 and 72 h after model preparation

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與miR-335模擬物對照組比較，P＜0.05；c表示與miR-335抑制物對照組比較，P＜0.05

組別 FBXL5 mRNA NCOA4 mRNA模型制備后12 h 模型制備后24 h 模型制備后72 h 模型制備后12 h 模型制備后24 h 模型制備后72 h假手術(shù)組 1.05±0.02 1.01±0.19 1.03±0.09 1.00±0.07 1.00±0.09 1.00±0.10模型組 0.69±0.07a 0.39±0.03a 0.64±0.02a 1.57±0.08a 1.43±0.08a 1.20±0.13a miR-335模擬物組 1.66±0.01b 1.27±0.30b 1.92±0.01b 0.42±0.12b 0.56±0.09b 0.30±0.12b miR-335模擬物對照組 1.04±0.00 1.03±0.10 1.04±0.00 1.02±0.01 1.02±0.01 1.03±0.02 miR-335抑制物組 0.85±0.14c 0.36±0.08c 0.66±0.01c 1.95±0.20c 1.58±0.21c 1.43±0.21c miR-335抑制物對照組 1.05±0.23 1.04±0.02 1.04±0.02 1.04±0.01 1.04±0.02 1.01±0.01 F值 17.10 33.10 66.09 12.89 28.8 37.29 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表5 六組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織FBXL5、NCOA4蛋白相對表達量比較（±s，n=10）Table 5 Comparison of relative expression levels of FBXL5 and NCOA4 proteins in brain tissue in six groups at 12，24 and 72 h after model preparation

表5 六組大鼠模型制備后12、24、72 h腦組織FBXL5、NCOA4蛋白相對表達量比較（±s，n=10）Table 5 Comparison of relative expression levels of FBXL5 and NCOA4 proteins in brain tissue in six groups at 12，24 and 72 h after model preparation

注：a表示與假手術(shù)組相比，P＜0.05；b表示與miR-335模擬物對照組比較，P＜0.05；c表示與miR-335抑制物對照組比較，P＜0.05

組別 FBXL5蛋白 NCOA4蛋白模型制備后12 h 模型制備后24 h 模型制備后72 h 模型制備后12 h 模型制備后24 h 模型制備后72 h假手術(shù)組 1.00±0.02 1.04±0.04 1.02±0.02 0.91±0.01 0.58±0.01 0.70±0.02模型組 0.61±0.02a 0.88±0.02a 0.90±0.01a 1.15±0.01a 0.78±0.01a 0.89±0.13a miR-335模擬物組 0.73±0.01b 1.03±0.05b 1.01±0.02b 0.89±0.02b 0.65±0.01b 0.55±0.01b miR-335模擬物對照組 0.48±0.01 0.70±0.01 0.62±0.01 0.95±0.01 1.07±0.03 0.82±0.01 miR-335抑制物組 0.65±0.05c 0.75±0.08c 0.43±0.01c 1.03±0.02c 1.17±0.01c 1.24±0.02c miR-335抑制物對照組 0.99±0.02 1.08±0.08 0.90±0.03 0.86±0.02 1.03±0.02 0.84±0.02 F值 367.200 180.70 293.70 180.90 677.20 204.70 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

IS具有高致殘率、高死亡率等特點，對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［12-13］。miR-335已被證實是參與IS過程的重要調(diào)節(jié)劑，其在腦I/R損傷中起著至關(guān)重要的作用［14］。本研究結(jié)果顯示，模型制備后12、24、72 h，miR-335模擬物組大鼠Zea Longa評分低于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠Zea Longa評分高于miR-335抑制物對照組；模型制備后12、24、72 h，模型組大鼠腦組織miR-335相對表達量低于假手術(shù)組，miR-335模擬物組大鼠腦組織miR-335相對表達量高于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠腦組織miR-335相對表達量低于miR-335抑制物對照組，與既往研究結(jié)果［15］一致，提示上調(diào)miR-335表達可有效減輕MCAO/R損傷模型大鼠神經(jīng)功能缺損程度，下調(diào)miR-335表達可加重MCAO/R損傷模型大鼠神經(jīng)功能缺損程度。SAMARAWEERA等［16］研究證實，miR-335可通過阻斷神經(jīng)元分化而維持非神經(jīng)元特征。此外，低水平miR-335可鑒別診斷IS患者與健康對照者，且miR-335水平降低是IS的獨立危險因素［17-18］。有動物實驗表明，大腦中動脈閉塞模型大鼠缺血皮質(zhì)中miR-335降低［19］。有體外與在體實驗表明，I/R與氧糖剝奪/再灌注（oxygenglucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）誘導(dǎo)的腦損傷24 h后miR-335下降［20］。miR-335可通過靶向rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2（rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2，ROCK2）而促進應(yīng)激顆粒的形成，進而抑制細胞凋亡，減輕大腦中動脈閉塞模型大鼠腦組織缺血性損傷程度［21］。

目前，IS患者有多種治療方法，其中包括針對程序性細胞死亡的治療策略。鐵死亡是一種新定義的程序性細胞死亡，其特征是脂質(zhì)過氧化的鐵依賴性積累達到致死水平，其或可成為IS新的治療靶點［22］。研究表明，I/R損傷可以通過選擇性自噬途徑誘導(dǎo)鐵蛋白自噬，這是一種將載鐵的鐵蛋白與釋放的不穩(wěn)定鐵一起輸送到溶酶體進行降解，隨后使神經(jīng)元中游離鐵增加的過程，該過程在全身鐵穩(wěn)態(tài)中具有重要作用［23］。NCOA4為選擇性自噬受體，其在介導(dǎo)腦組織和細胞鐵蛋白自噬中具有至關(guān)重要的作用［24］。近期，NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵機制，其過度激活會促進游離鐵釋放增多，而過量的游離鐵又可通過芬頓反應(yīng)而導(dǎo)致鐵死亡［4，25］。大量研究表明，調(diào)節(jié)FBXL5對于鐵穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要［26-27］。FBXL5是F-box蛋白家族成員，其特定結(jié)構(gòu)域可感知鐵和氧并直接結(jié)合鐵，因而其可作為哺乳動物細胞鐵代謝的主要調(diào)節(jié)劑［28-30］。研究表明，F(xiàn)BXL5缺乏會導(dǎo)致鐵調(diào)節(jié)蛋白的持續(xù)積累和不受調(diào)節(jié)的鐵攝取，最終導(dǎo)致鐵過載和活性氧的產(chǎn)生［23］。YAMAUCHI等［5］進行的動物實驗表明，小鼠腦組織缺失FBXL5會誘導(dǎo)神經(jīng)干祖細胞異常增殖，從而影響大腦發(fā)育，而全身缺乏FBXL5的小鼠由于鐵過載和氧化應(yīng)激而導(dǎo)致其細胞內(nèi)鐵水平紊亂并在子宮內(nèi)死亡。為了驗證miR-335是否通過調(diào)控FBXL5、NCOA4表達而減輕MCAO/R損傷模型大鼠神經(jīng)功能損傷程度，本研究于大鼠大腦中動脈腦立體定位注射miR-335模擬物/抑制物腺相關(guān)病毒，結(jié)果顯示，模型制備后12、24、72 h，模型組大鼠腦組織FBXL5 mRNA、蛋白相對表達量低于假手術(shù)組，miR-335模擬物組大鼠腦組織FBXL5 mRNA、蛋白相對表達量高于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠腦組織FBXL5 mRNA、蛋白相對表達量低于miR-335抑制物對照組；模型組大鼠腦組織NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量高于假手術(shù)組，miR-335模擬物組大鼠腦組織NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量低于miR-335模擬物對照組，miR-335抑制物組大鼠腦組織NCOA4 mRNA、蛋白相對表達量高于miR-335抑制物對照組，提示上調(diào)miR-335表達有效減輕MCAO/R損傷模型大鼠神經(jīng)功能缺損程度的機制可能與其促進FBXL5表達、抑制NCOA4表達，調(diào)控鐵自噬與鐵代謝，進而影響鐵死亡有關(guān)。

綜上所述，上調(diào)miR-335表達可有效減輕MCAO/R損傷模型大鼠神經(jīng)功能缺損程度，其機制可能與miR-335促進FBXL5表達、抑制NCOA4表達，調(diào)控鐵自噬與鐵代謝，進而影響鐵死亡有關(guān)，這為治療IS導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷提供了理論依據(jù)。

作者貢獻：袁莉進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；陳煒進行研究的實施與可行性分析；李麗琴進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；向軍軍進行結(jié)果分析與解釋；胡躍強、姚春負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。