Delta 樣蛋白1 同源物與生長激素腺瘤臨床表型的關系及其對生長激素的影響研究

賈煥珍，陳一元，趙斯達，鄭淑榮

垂體腺瘤是最常見的神經系統腫瘤之一，其中生長激素（growth hormone，GH）腺瘤約占所有垂體腺瘤的15%～20%［1］。GH腺瘤患者的臨床表現為腫瘤分泌過量的GH而引起肢端肥大癥，其可明顯增加呼吸系統疾病、心血管系統疾病和惡性腫瘤的發生率，嚴重影響患者的生存質量［2-3］。經鼻蝶內鏡手術切除是GH腺瘤的首選治療方法，但25%～40%患者的腫瘤侵襲海綿竇、頸內動脈、下丘腦等重要結構，屬于難治性腺瘤，具體表現為手術全切率低、腫瘤復發率高、患者對現有藥物不敏感、患者術后GH水平控制不佳，是目前臨床治療的難點［4］。因此，探尋GH腺瘤的發生發展機制對開發新的藥物具有重要意義。

研究發現，印記基因失調與早期胚胎發育、癌變和腫瘤易感性密切相關，是目前腫瘤研究的熱點之一［5］。位于人類染色體14q32.2區的印記基因Delta樣蛋白1同源物（Delta-like homolog 1，DLK1）在細胞分化和組織發育中起著至關重要的作用［6-7］。DLK1在大部分人無功能性垂體腺瘤中沉默，而在功能性垂體腺瘤中表達［8-9］。DLK1在發育中的垂體表達，并主要局限于成年小鼠垂體中的生長滋養細胞；在DLK1缺失小鼠的整個生命周期中，DLK1缺失導致GH含量明顯減少［10］。本研究旨在分析DLK1在GH腺瘤中的表達情況及其臨床意義，以期為GH腺瘤的臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年10月至2022年6月。

1.2 實驗材料

1.2.1 腫瘤標本來源 腫瘤標本來自2016—2020年于首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科行手術切除的34例GH腺瘤患者，其中男18例，女16例；年齡22～68歲，中位年齡44歲；腫瘤體積（7.7±1.5）cm3；Knosp分級：Ⅰ～Ⅱ級20例，Ⅲ～Ⅳ級14例；血清GH（5.1±1.6）μg/L。本研究獲得首都醫科大學附屬北京天壇醫院倫理委員會批準（倫理批號：KY2016-035-01）。

1.2.2 主要實驗試劑 ［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內鹽；MTS］購自Promega公司，胎牛血清購自Gibco公司，抗DLK1、GH、磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶（phosphorylated p70 ribosomal protein S6 kinase，p-p70S6K）、磷酸化起始因子4E結合蛋白1（phosphorylated eukaryotic initiation factor 4E-binding protein1，p-4EBP1）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mechanistic target of rapamycin，p-mTOR）抗體購自Abcam公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，RIPA裂解液和GH ELISA試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司，大鼠GH3細胞購自美國ATCC公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色檢測腫瘤標本中DLK1、GH表達情況 將腫瘤標本蠟塊連續切片、厚度為4 μm，60 ℃烤片1 h，采用二甲苯和乙醇溶液進行梯度脫蠟，采用枸櫞酸鈉緩沖溶液于95 ℃修復抗原5 min，然后將組織切片置于0.3%過氧化氫中，室溫孵育10 min，滴加羊血清，封閉30 min，加入DLK1一抗（1∶500）或GH一抗（1∶1 000），覆膜后于4 ℃孵育過夜；采用PBS洗3次；加二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次，然后以二氨基聯苯胺顯色；進行梯度脫水后封固。以細胞內有淡黃色、黃色或者褐色、棕褐色顆粒為陽性，按照陽性細胞占比將腫瘤標本的臨床表型分為稀疏顆粒型（＜25%）標本和致密顆粒型（≥25%）標本。在光學顯微鏡下計數陽性細胞，每張片子取3個低倍視野，進行免疫組化染色評分。評分范圍為0～300分，評分標準：陽性細胞占比（0～100%）×染色強度（0：陰性，1：染色淡黃色，2：染色黃色，3：染色棕褐色）。實驗獨立重復3次。

1.3.2 細胞培養 將大鼠GH3細胞培養于F12-K培養基中（含2.5%胎牛血清和10%馬血清），培養箱條件為5%CO2，37 ℃。每2 d更換一次培養基。當GH3細胞貼壁生長到90%時，用0.25%的胰酶消化，進行1∶2傳代。

1.3.3 細胞增殖實驗檢測細胞活力 取對數生長期的大鼠GH3細胞，調整至105個/ml，96孔板中每孔加入100 μl細胞懸液，將其隨機分為A組、B組、C組、D組，過夜后，B組、C組、D組分別加入1、5、20 μg/ml抗DLK1抗體，A組加入等體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。分別于培養0、24、48、72 h后，每孔加入20 μl［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內鹽；MTS］繼續孵育3 h，采用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度值，即細胞活力。實驗獨立重復3次。

1.3.4 ELISA檢測GH3細胞培養上清液中GH水平 取對數生長期的大鼠GH3細胞，調整至105個/ml，96孔板中每孔加入100 μl細胞懸液，將其隨機分為E組、F組，過夜后，F組加入5 μg/ml抗DLK1抗體，E組加入等體積的DMSO。各組細胞培養0、24、48、72 h后，每孔取20 μl培養上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測GH水平。實驗獨立重復3次。

1.3.5 Western blot法檢測GH3細胞中p-p70S6K、p-4EBP1、p-mTOR水平 取對數生長期的大鼠GH3細胞，調整至105個/ml，96孔板中每孔加入100 μl細胞懸液，將其隨機分為G組、H組、I組、J組，過夜后，H組、I組、J組分別加入1、5、20 μg/ml抗DLK1抗體，G組加入等體積的DMSO。各組細胞培養24 h后用胰酶消化，用冷PBS洗2遍，1 000 r/min離心5 min（離心半徑13.5 cm），收集細胞，加入100 μl RIPA裂解液，冰上孵育2 h，參考文獻［11］進行蛋白提取、電泳和轉膜；加入抗p-p70S6K（1∶1 000）、p-4EBP1（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、β-actin（1∶8 000）抗體，孵育過夜；用TBST洗膜3次，10 min/次；加入二抗（1∶8 000），室溫封閉30 min；用TBST洗膜3次，加入ECL發光劑，使用Amersham Image 600掃描條帶并計算灰度值，即為目標蛋白水平。實驗獨立重復3次。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計量資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；兩變量間的相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果 DLK1主要位于稀疏顆粒型腫瘤標本的細胞核及致密顆粒型腫瘤標本的細胞質，GH主要位于稀疏顆粒型、致密顆粒型腫瘤標本的細胞質，見圖1。腫瘤標本的DLK1評分為（112.3±8.3）分，GH評分為（173.5±13.6）分。

圖1 腫瘤標本的免疫組織化學染色結果Figure 1 Immunohistochemical staining results of tumor samples

2.2 DLK1評分與GH評分的相關性 Pearson相關分析結果顯示，腫瘤標本的DLK1評分與GH評分呈正相關（r=0.550，P＜0.001），見圖2。

圖2 腫瘤標本的DLK1評分與GH評分的相關性Figure 2 Correlation between DLK1 score and GH score of tumor samples

2.3 高DLK1評分組與低DLK1評分組患者臨床特征及腫瘤標本GH評分、臨床表型比較 根據DLK1評分中位數將腫瘤標本分為高DLK1評分組（≥110分，n=17）和低DLK1評分組（＜110分，n=17）。高DLK1評分組與低DLK1評分組患者性別、年齡、腫瘤體積、Knosp分級比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；高DLK1評分組患者血清GH及腫瘤標本GH評分、臨床表型為致密顆粒型者占比高于低DLK1評分組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 高DLK1評分組與低DLK1評分組患者臨床特征及腫瘤標本GH評分、臨床表型比較Table 1 Comparison of clinical characteristics of patients，GH score and clinical phenotype of tumor samples between high DLK1 score group and low DLK1 score group

2.4 細胞活力 A組、B組、C組、D組培養0 h后細胞活力比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；A組、B組、C組、D組培養24、48、72 h后細胞活力比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。B組培養48、72 h后細胞活力高于A組，C組、D組培養24、48、72 h后細胞活力高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C組培養48 h后細胞活力高于B組，D組培養24、48、72 h后細胞活力高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組培養48、72 h后細胞活力高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組、B組、C組、D組培養24、48、72 h后細胞活力分別高于本組培養0 h后，培養48、72 h后細胞活力分別高于本組培養24 h后，培養72 h后細胞活力分別高于本組培養48 h后，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 A組、B組、C組、D組不同時間細胞活力比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell viability among group A，group B，group C and group D at different time

表2 A組、B組、C組、D組不同時間細胞活力比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell viability among group A，group B，group C and group D at different time

注：a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05；d表示與本組培養0 h后比較，P＜0.05；e表示與本組培養24 h后比較，P＜0.05；f表示與本組培養48 h后比較，P＜0.05

組別 培養0 h后 培養24 h后 培養48 h后 培養72 h后A組0.342±0.015 0.435±0.023d 0.612±0.023de 0.831±0.032def B組 0.342±0.015 0.495±0.026d 0.735±0.035ade 1.040±0.045adef C組 0.342±0.015 0.543±0.017ad 0.867±0.037abde 1.186±0.042adef D組0.342±0.015 0.586±0.016abd 0.943±0.038abcde 1.592±0.072abcdef F值 0 9.806 39.580 49.460 P值 1.000 0.005 ＜0.001 ＜0.001

2.5 GH3細胞培養上清液中GH水平 E組與F組培養0、24 h后GH3細胞培養上清液中GH水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；F組培養48、72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平低于E組，差異有統計學意義（P＜0.05）。E組培養48、72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平高于本組培養0 h后，F組培養48、72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平低于本組培養0 h后，差異有統計學意義（P＜0.05）；E組培養72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平高于本組培養24 h后，F組培養72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平低于本組培養24 h后，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 E組與F組不同時間GH3細胞培養上清液中GH水平比較（±s，ng/ml，n=3）Table 3 Comparison of GH levels in culture medium of GH3 cells between group E and group F at different time

表3 E組與F組不同時間GH3細胞培養上清液中GH水平比較（±s，ng/ml，n=3）Table 3 Comparison of GH levels in culture medium of GH3 cells between group E and group F at different time

注：a表示與本組培養0 h后比較，P＜0.05；b表示與本組培養24 h后比較，P＜0.05

組別 培養0 h后 培養24 h后 培養48 h后 培養72 h后E組 7.20±0.32 8.15±0.57 10.33±0.77a 12.70±0.95ab F組 7.20±0.32 6.65±0.52 5.41±0.33a 4.88±0.33ab t值 0 1.947 5.882 7.819 P值 1.000 0.123 0.004 0.001

2.6 GH3細胞中p-p70S6K、p-4EBP1、p-mTOR水平G組、H組、I組、J組GH3細胞中p-p70S6K、p-4EBP1、p-mTOR水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。H組、I組、J組GH3細胞中p-p70S6K水平高于G組，J組GH3細胞中p-p70S6K水平低于H組、I組，差異有統計學意義（P＜0.05）；I組、J組GH3細胞中p-4EBP1水平低于G組、H組，差異有統計學意義（P＜0.05）；H組、I組、J組GH3細胞中p-mTOR水平高于G組，I組、J組GH3細胞中p-mTOR水平高于H組，J組GH3細胞中p-mTOR水平高于I組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 G組、H組、I組、J組GH3細胞中p-p70S6K、p-4EBP1、p-mTOR水平比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of p-p70S6K，p-4EBP1，p-mTOR levels in GH3 cells among group G，group H，group I and group J

表4 G組、H組、I組、J組GH3細胞中p-p70S6K、p-4EBP1、p-mTOR水平比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of p-p70S6K，p-4EBP1，p-mTOR levels in GH3 cells among group G，group H，group I and group J

注：p-p70S6K=磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶，p-4EBP1=磷酸化起始因子4E結合蛋白1，p-mTOR=磷酸化雷帕霉素靶蛋白；a表示與G組比較，P＜0.05；b表示與H組比較，P＜0.05；c表示與I組比較，P＜0.05

組別 p-p70S6K p-4EBP1 p-mTOR G組 0.82±0.05 1.12±0.07 0.32±0.05 H組 3.49±0.23a 1.34±0.12 0.71±0.07a I組 2.76±0.23a 0.54±0.08ab 1.07±0.05ab J組 1.54±0.13abc 0.35±0.04ab 1.56±0.12abc F值 45.61 31.68 43.70 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

基因組印跡是一種導致特定基因根據親本來源進行單等位基因表達的表觀遺傳現象，其與早期胚胎發育、癌變和腫瘤易感性密切相關，是目前腫瘤研究的熱點之一［12］。研究顯示，印記基因表達失調可對胚胎生長和發育產生明顯影響，其與人類代謝紊亂也有關［13］。文獻報道，定位于人類染色體14q32.2區的DLK1/母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）基因座在細胞分化和組織發育過程中發揮著重要作用，其可參與機體多種生理和病理過程［14］。DLK1/MEG3基因座內主要包含3個編碼蛋白的父系印跡基因，分別為DLK1、逆轉錄轉座子樣1（retrotransposon-like 1，RTL1）和碘甲腺原氨酸脫碘酶3（type 3 iodothyronine deiodinase，DIO3），另外，其還包含MEG3、MEG8、MEG9等多個母系長鏈非編碼RNA以及大量的miRNA［15］。研究顯示，DLK1缺失小鼠體質量、個頭小于野生型同窩小鼠，血清GH水平低于野生型同窩小鼠，說明DLK1可控制GH的分泌與釋放［16］。DLK1/MEG3基因座的miRNA可降低結節性硬化復合物1（tuberous sclerosis complex 1，TSC1）基因敲除小鼠肝細胞的糖異生能力、空腹血糖水平及減少葡萄糖不耐受［17］。上述研究表明，DLK1/MEG3基因座對腫瘤的臨床表型和功能均存在一定影響，具有很大的研究價值。本研究旨在分析DLK1在GH腺瘤中的表達情況及其臨床意義。

本研究結果顯示，DLK1主要位于稀疏顆粒型腫瘤標本的細胞核及致密顆粒型腫瘤標本的細胞質，且高DLK1評分組腫瘤標本臨床表型為致密顆粒型者占比高于低DLK1評分組，提示DLK1主要在致密顆粒型GH腺瘤中表達，說明DLK1水平可能與GH腺瘤的臨床表型有關。

本研究結果顯示，腫瘤標本的DLK1評分與GH評分呈正相關，高DLK1評分組患者血清GH及腫瘤標本GH評分高于低DLK1評分組，提示DLK1可促進GH的合成和分泌。本研究觀察了不同濃度抗DLK1抗體對GH腺瘤來源的GH3細胞的增殖能力和激素分泌能力的影響，結果顯示：B組培養48、72 h后細胞活力高于A組，C組、D組培養24、48、72 h后細胞活力高于A組，C組培養48 h后細胞活力高于B組，D組培養24、48、72 h后細胞活力高于B組，D組培養48、72 h后GH3細胞活力高于C組；A組、B組、C組、D組培養24、48、72 h后細胞活力分別高于本組培養0 h后，培養48、72 h后細胞活力分別高于本組培養24 h后，培養72 h后細胞活力分別高于本組培養48 h后；提示不同濃度抗DLK1抗體均可以時間依賴性方式促進GH3細胞增殖。F組培養48、72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平低于E組；E組培養48、72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平高于本組培養0 h后，F組培養48、72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平低于本組培養0 h后；E組培養72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平高于本組培養24 h后，F組培養72 h后GH3細胞培養上清液中GH水平低于本組培養24 h后；提示抗DLK1抗體可抑制GH的分泌。上述研究結果證實，DLK1可抑制GH3細胞增殖，增加血清GH水平。

此外，本研究結果顯示，H組、I組、J組GH3細胞中p-p70S6K水平高于G組，J組GH3細胞中p-p70S6K水平低于H組、I組；I組、J組GH3細胞中p-4EBP1水平低于G組、H組；H組、I組、J組GH3細胞中p-mTOR水平高于G組，I組、J組GH3細胞中p-mTOR水平高于H組，J組GH3細胞中p-mTOR水平高于I組；提示抗DLK1抗體可升高p-p70S6K、p-mTOR水平，降低p-4EBP1水平，說明DLK1可抑制GH3細胞中p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）的磷酸化，促進起始因子4E結合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4E-binding protein1，4EBP1）的磷酸化，這與既往研究結果［18］相似。推測DLK1通過抑制GH3細胞中p70S6K、mTOR的磷酸化及促進4EBP1的磷酸化來調控GH的表達。ANSELL等［19］研究結果還顯示，DLK1可通過PIT1轉錄因子調控GH的表達。

綜上所述，DLK1主要在致密顆粒型GH腺瘤中表達；DLK1可抑制GH3細胞增殖，增加血清GH水平，其機制可能與DLK1抑制GH3細胞中p70S6k、mTOR的磷酸化及促進4EBP1的磷酸化有關。然而，本研究標本量較小，且為細胞實驗，所得結論仍需大樣本量的臨床研究進一步證實。

作者貢獻：賈煥珍負責數據收集，撰寫論文；陳一元、趙斯達負責數據整理、分析；陳一元、鄭淑榮負責文章的質量控制；鄭淑榮進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。