乳酸菌發酵獼猴桃汁的工藝優化

劉曉翠，李仲巧，朱慧君，艾青雪，李佳敏，熊月，劉清，康永琪

（西華大學食品與生物工程學院,四川 成都 610039）

獼猴桃富含有機酸、游離氨基酸、維生素、糖類、膳食纖維及人體所需的多種礦物質[1]。獼猴桃果實不僅能夠降低血液中膽固醇和甘油三酯含量，在治療壞血病、冠心病、高血壓以及動脈粥樣硬化等方面也有一定的功效[2]，而且獼猴桃還有提高免疫力，美容養顏等多種保健作用[3]。研究[4]表明，獼猴桃與橙、葡萄柚相比較具有更強的抗氧化作用，能夠抑制人體中生物物質的氧化[5]。獼猴桃可以抑制早期脂質氧化，可以防止由氧化應激引起的疾病的發展和惡化[6]。

功能性食品能對人體的生物功能產生積極影響，降低食用者患疾病的風險，這一食品類別包括所有含有益生菌微生物的產品[6]。目前，應用于果蔬發酵的益生菌大約有20種，主要有嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和明串珠菌等[7]。發酵后的果蔬汁不但口感醇厚，而且還存在很多活性乳酸菌，有助于腸道環境的改善[8-10]。最初是將果汁和牛奶混合后用乳酸菌進行發酵，當僅為果汁發酵時，就需要選取適合發酵的菌株[11]。

紅心獼猴桃屬漿果類水果，其果肉細嫩、口感香甜清爽、酸度極低，但易腐爛變質，不易長期貯藏。將紅心獼猴桃榨汁，用乳酸菌發酵，再用發酵獼猴桃汁為原料生產果酒、果醋等產品，是解決紅心獼猴桃貯藏問題的有效途徑之一。因此，對乳酸菌發酵獼猴桃汁的工藝進行優化，從而提高發酵獼猴桃汁品質具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

新鮮紅心獼猴桃購于四川蒲江；嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌購于鄭州百益寶生物技術有限公司；果膠酶購于晟發生物科技有限公司；福林酚、2，6-二氯靛酚購于源葉生物科技有限公司；抗壞血酸購于天津市致遠化學試劑有限公司；草酸購于天津市津東天正精細化學試劑廠；氯化鉀、鹽酸、乙醇（體積分數為95%）購于成都市科隆化學品有限公司；無水乙酸鈉、氫氧化鈉、偏磷酸購于天津市風船化學試劑科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

UV-2600 型紫外可見分光光度計購于尤尼柯(上海)儀器有限公司；G154DWs 型高溫滅菌鍋購于上海賽海洋生物科技實業有限公司；A610 型數字阿貝折射儀購于濟南海能股份有限公司；pHs-320 型pH 計購于成都世紀方舟科技有限公司；SH-3 加熱磁力攪拌器購于天津泰斯特有限公司；902-ULTS 超低溫冰箱購于賽默飛世爾；萬分之一天平購于賽多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

選擇新鮮飽滿，無蟲害無腐爛的獼猴桃，放入60 ℃熱水中清洗去皮后榨汁，再加入3%的果膠酶，在30 ℃條件下保持4 h，然后用雙層細紗布過濾，除去濾渣，同時做空白對照。然后加入適量的維生素C 進行護色處理。然后將進行65 ℃、20 min巴氏滅菌后的樣品裝入經121 ℃、20 min 高溫滅菌的發酵罐。將嗜酸乳桿菌（R2）、保加利亞乳桿菌（R3）、干酪乳桿菌（R4）、嗜酸乳桿菌+保加利亞乳桿菌（R5）、嗜酸乳桿菌+干酪乳桿菌（R6）、保加利亞乳桿菌+干酪乳桿菌（R7）按獼猴桃質量的3%的接種量（復配組復配比為1∶1）接種于1 000 mL獼猴桃汁中，自然發酵編號為R1。將發酵罐放置于陰暗處，自然避光發酵0、4、8、12、16、20、24 d。

1.2.2 理化指標

1.2.2.1 總酚含量的測定

總酚含量的測定采用的是福林酚法。將發酵獼猴桃汁先用蒸餾水稀釋40倍，然后取稀釋后的發酵獼猴桃汁樣品1 mL 與0.5 mL 福林酚試劑混合，再加入6.5 mL 10%的Na2CO3溶液，搖勻，避光靜置1 h后，測定發酵獼猴桃汁在700 nm 處的吸光值。

1.2.2.2 抗壞血酸含量的測定

抗壞血酸含量參照GB5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》中的2，6-二氯靛酚滴定法進行測定。

1.2.2.3 花色苷含量的測定

本試驗采用pH 示差法測定發酵獼猴桃汁中花色苷的含量。

1）緩沖液的配制。pH1.0 緩沖液：使用電子分析天平準確稱量186 g 氯化鉀，加蒸餾水約980 mL，用鹽酸和酸度計將pH 調至pH1.0，再用蒸餾水定容1 000 mL。

pH4.5 緩沖液：使用電子分析天平準確稱量32.81 g 無水乙酸鈉，加蒸餾水約980 mL，用鹽酸和酸度計將pH 調至pH4.5，再用蒸餾水定容1 000 mL。

2）花色苷含量的測定。取待測樣品溶液0.5 mL，分別用4.5 mL pH1.0 緩沖液(0.025 mol/L)、4.5 mL pH4.5 緩沖液（0.4 mol/L）稀釋，混勻后，室溫避光放置15 min后，以蒸餾水作為對照，分別在516 nm和700 nm 處測吸光值，計算花色苷含量。花色苷含量以mg/L計，按照公式（1）、（2）進行計算。

式中：C，花色苷含量，mg/L；A0，pH1.0 時吸光值；A1，pH4.5 時吸光值；Mw，以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標準，為449.2；ε，26 900；D，樣品稀釋倍數。

1.2.2.4 DPPH 自由基清除率的測定

將發酵獼猴桃汁稀釋到50 mg/mL，取樣液1.0 mL 及濃度為0.12 mmoL/L 的DPPH-乙醇溶液（乙醇體積分數為95%）4.00 mL，混勻，室溫下避光反應30 min，如有沉淀可在5 500 r/min 條件下離心5 min。用95%（體積分數）乙醇溶液參比，在517 nm 測定吸光值。根據公式（3）計算每種樣品DPPH 自由基的清除率[12]：

式中：Ai，加樣品液后溶液的吸光值；Aj，樣品液的吸光值；Ac，未加樣品液時溶液的吸光值。

1.2.2.5 獼猴桃汁發酵過程中pH 的測定

量取50 mg/mL 的發酵獼猴桃汁50 mL 樣品于100 mL 燒杯中（發酵獼猴桃汁足夠浸沒電極），用pH 計測定樣品，并記錄pH 值。

1.2.2.6 獼猴桃汁發酵過程中果實TSS 質量分數的測定

果實TSS 質量分數參照NY/T 2 637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》進行測定。

1.2.2.7 獼猴桃汁發酵過程中TA 含量的測定

TA 含量參照GB 12456—2021 《食品安全國家標準 食品中總酸的測定進行測定》。

1.3 數據分析

使用IBM SPSS Statistics 26 進行理化因子顯著性分析，顯著性水平設置為α=0.05，單因素ANOVA檢驗方法選擇圖基（T），用不同的小寫字母表示處理之間存在的顯著差異（P<0.05 或P<0.01）。柱狀圖用Origin 2022 軟件繪制。相關性分析使用IBM SPSS Statistics 26 進行，方法選擇Pearson 分析方法。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃汁發酵過程中總酚含量的變化

由圖1 可知，與R1 相比，添加了乳酸菌的獼猴桃汁中的總酚含量保持在較高的水平。發酵初測得的獼猴桃汁總酚含量為94.57 mg/100 mL，發酵結束后測得自然發酵R1 的總酚含量為69.54 mg/100 mL，相比發酵前降低了26.47%；添加乳酸菌的獼猴桃汁R2-R7 在發酵24 d 后的總酚含量分別為80.41、80.56、73.32、90.26、80.77、90.66 mg/100 mL，而R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的獼猴桃汁在發酵24 d后，測得總酚的含量高達90.66 mg/100 mL，與發酵初期測得的總酚含量相比較，僅下降了4.13%。

圖1 發酵期間發酵獼猴桃汁總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenol content in fermented kiwifruit juice during fermentation

植物中的酚類物質一般都具有較強的抗氧化活性，是植物中重要的功能性成分，它因為具有氧化還原性質，可以用作還原劑、氫供體和金屬螯合劑[13-14]。隨著發酵時間的變長，獼猴桃果汁中總酚的含量變化呈先上升然后再下降的趨勢。總酚含量上升的原因可能有兩個：一是因為在獼猴桃發酵期間，乳酸菌在獼猴桃汁中產生的各種有機酸、酮、醇等可抑制PPO 活性物質，有利于防止酚類物質的氧化；二是因為乳酸菌在代謝過程產生了很多酚酸酯酶等酶類，這些酶能夠釋放獼猴桃汁中的酚類物質[15-16]，從而使得獼猴桃汁中酚類含量得到補償，因此在發酵初期總酚的含量能夠上升[17]。總酚含量變化可能是發酵期間，因乳酸菌的應激作用而對酚類物質進行的生物代謝導致發酵結束后獼猴桃汁中酚類物質的減少引起的[18-19]。

2.2 獼猴桃汁發酵過程中抗壞血酸含量的變化

由圖2 可知，隨著發酵時間的延長，抗壞血酸含量呈現出下降的趨勢。獼猴桃汁發酵初抗壞血酸含量為0.214 mg/L，獼猴桃汁在發酵24 d后，R1的抗壞血酸含量為0.084 mg/L，下降了60.75%左右；添加乳酸菌的獼猴桃汁R2-R7 在發酵24 d 后的抗壞血酸含量分別為0.101、0.102、0.112、0.094、0.105、0.136 mg/L，R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的獼猴桃汁在發酵24 d后，抗壞血酸的含量達到0.136 mg/L，高于其他發酵組。新鮮獼猴桃汁中含有豐富的抗壞血酸，但該化合物不穩定，在加工過程中容易變質。蔡麗琴[20]發現獼猴桃在發酵過程中抗壞血酸的含量逐漸下降且接種發酵組比自然發酵組含量更高。劉洪[21]的研究結果也表明在泡菜的發酵過程中抗壞血酸的含量逐漸下降且接種發酵組比自然發酵組含量更高。綜合對比表明實驗結果與已有研究結果具有一致性。因此能夠得到保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配更適合獼猴桃汁的發酵的結論。

圖2 發酵期間發酵獼猴桃汁抗壞血酸含量的變化Fig.2 Changes of ascorbic acid content in fermented kiwifruit juice during fermentation

2.3 獼猴桃汁發酵過程中花色苷含量的變化

獼猴桃中富含花色苷，花色苷是獼猴桃的主要呈色物質和功能性成分，紅心獼猴桃果實中有5 種花色苷，分別是未知矢車菊素（Cy.）、矢車菊素-3-O-木糖（1-2）-半乳糖苷（Cy-xyL.gaL.）、矢車菊素-3-O-半乳糖苷（Cy-gaL.）、飛燕草-3-O-木糖（1-2）-半乳糖苷（Dp-xyL.gaL.）和飛燕草-3-O-半乳糖苷（DpgaL.）。植物源花色苷具有豐富的生理活性，如抗癌、抗氧化、抗衰老等，還沒有毒副作用，因此可作為天然色素直接使用，也可以經過乳化或以粉末形式廣泛用于食品添加劑等領域[22-24]。

由圖3 的變化趨勢可知，R1 自然發酵的獼猴桃汁變化最大，其他的獼猴桃汁因為添加了乳酸菌延緩了花色苷的降解速度。發酵前獼猴桃汁的花色苷含量為62.08 mg/L，獼猴桃汁在發酵24 d后，R1 花色苷含量為5.58 mg/L，下降率達到了91%；添加乳酸菌的獼猴桃汁R2-R7 在發酵24 d 后的花色苷含量分別為15.48、19.34、10.80、10.23、10.71、26.79 mg/L，R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的獼猴桃汁在發酵24 d后，花色苷的含量高于其他發酵組。隨著發酵時間的延長，花色苷的含量也隨之減少。花色苷含量降低原因有兩個：一是因為發酵環境中氧氣和微生物的代謝使得花色苷發生了氧化降解；二是由于發酵期間花青素的聚合和降解反應以及花色苷與其他酚類物質的相互作用造成了花色苷含量的減少[25-26]。

圖3 發酵期間發酵獼猴桃汁花色苷含量的變化Fig.3 Changes of anthocyanin content in fermented kiwifruit juice during fermentation

2.4 獼猴桃汁發酵過程中DPPH 自由基清除率的變化

DPPH 為商業合成的自由基，一般溶于有機溶劑，用于有機相內的抗氧化反應。本次試驗通過監測DPPH 自由基清除率的變化情況來評價發酵過程中獼猴桃汁抗氧化活性的變化。由圖4 可知，隨著發酵時間延長，DPPH 自由基清除率是先上升再下降的趨勢。發酵4 d 左右，各獼猴桃汁的抗氧化活性有小幅度上升的趨勢。發酵8 d后，各組獼猴桃汁的抗氧化活性開始顯著下降。獼猴桃汁發酵前DPPH 自由基清除率為77.52%，獼猴桃汁在發酵24 d后，R1 自然發酵組的DPPH 自由基清除率為44.15%，下降了43.05%；添加乳酸菌的獼猴桃汁R2-R7 在發酵24 d 后的DPPH 自由基清除率分別為：35.69%、41.51%、38.04%、38.75%、36.62%、29.75%，分別下降了52.69%、46.45%、50.93%、50.01%、52.76%、61.62%，抗氧化活性普遍下降比較厲害。DICR 等[27]應用戊糖片球菌和植物乳桿菌混合發酵甜櫻桃果泥，提高了抗氧化能力；同時也有文獻[28-30]指出，乳酸菌發酵能降低果蔬對自由基的清除能力。DPPH自由基清除能力與總酚有很大的關系，酚類物質經過乳酸菌發酵后分解成鞣花酸，提高了它的生物利用率和抗氧化活性[30]。

圖4 發酵期間發酵獼猴桃汁DPPH 自由基清除率的變化Fig.4 Changes of DPPH free radical scavenging rate in fermented kiwifruit juice during fermentation

2.5 獼猴桃汁發酵過程中pH、TSS 質量分數、TA 含量的變化

由圖5 可知，整個發酵期間，各組獼猴桃汁的pH 都呈現出下降并達到穩定的趨勢。這是因為乳酸菌在發酵初期，pH 適宜，生長速度最快，能夠進行糖酵解作用產生大量的乳酸使得pH 下降；到發酵后期各組發酵獼猴桃汁的pH 趨于穩定，是因為發酵后期乳酸量過多抑制了乳酸菌的活動，并且發酵環境碳源較少，使得發酵液中的pH 達到平衡，趨于穩定。由圖5 可知，R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的發酵獼猴桃汁pH 下降最快，表明保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌可以更快速地代謝產生乳酸菌，因此可以得到保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配更適合獼猴桃汁的發酵的結論。

圖5 發酵期間發酵獼猴桃汁pH 的變化Fig.5 Changes in pH of fermented kiwi juice during fermentation

由圖6 可知，隨著發酵時間的延長，各組獼猴桃汁TSS 的質量分數隨之下降，發酵前獼猴桃汁的TSS 質量分數為21.4%，獼猴桃汁在發酵24 d后，R1 的TSS 質量分數為10.53%，添加乳酸菌的獼猴桃汁R2-R7 在發酵24 d 后的TSS 質量分數分別為9.27%、8.2%、8.17%、10.2%、8.77%、5%，而R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的獼猴桃汁在發酵24 d后，TSS 的質量分數低于其他發酵組，并且添加了R2-R7 組的TSS 質量分數下降速度明顯高于自然發酵組R1。這是因為乳酸菌利用獼猴桃汁中豐富的糖類物質進行了代謝，促進了TSS 的分解，因此提高了TSS 的轉化利用率。但由于在發酵后期乳酸菌的累積使得pH 下降，抑制了乳酸菌的代謝，從而使得糖轉化率下降，TSS 質量分數下降趨勢減緩。據數據分析，由圖6 也可得到，R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的獼猴桃汁的TSS 質量分數（5.00%）低于其他組的TSS 質量分數，表明保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌的代謝速度較快，與pH 變化趨勢相同，因此可以得到保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配更適合獼猴桃汁的發酵的結論。

圖6 發酵期間發酵獼猴桃汁TSS 質量分數的變化Fig.6 Changes in TSS of fermented kiwi juice during fermentation

由圖7 可知，發酵期間，各組獼猴桃汁的TA 含量總體呈上升的趨勢。發酵前獼猴桃汁的TA含量為0.73 mg/L，獼猴桃汁在發酵24 d后，R1 的TA 含量為1.35 mg/L；添加乳酸菌的獼猴桃汁R2-R7 在發酵24 d 后的TA 含量分別為：2.28、2.08、2.66、2.64、2.85、3.04 mg/L。添加了乳酸菌的R2-R7 組的TA 含量的增加速度明顯大于自然發酵組R1，并且R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的獼猴桃汁在發酵24 d后，TA 的含量高于其他發酵組。獼猴桃汁中的TA 主要是有機酸，如檸檬酸、蘋果酸等，是發酵獼猴桃汁主要的呈味物質之一[31-32]。通過實驗數據可知，乳酸菌發酵過程中產生了大量的乳酸，TA 的含量逐漸增加，因此乳酸菌發酵比自然發酵能夠增加更多的TA。據數據分析，R2-R7 的TA 含量都明顯高于R1，R7 保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配的獼猴桃汁的TA 含量高于其他組的TA 含量，R7 的TA 含量能夠達到3.04 mg/L，表明保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌的代謝速度較快，能產生更多的乳酸，與pH 變化趨勢相同，因此可以得到保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌復配更適合獼猴桃汁的發酵的結論。

圖7 發酵期間發酵獼猴桃汁TA 含量的變化Fig.7 Changes of TA in fermented kiwi juice during fermentation

2.6 相關性和顯著性分析

對R7 發酵獼猴桃汁的各項指標進行分析，結果見表1。發酵獼猴桃汁的花色苷含量、DPPH 自由基清除率、pH、TSS 質量分數均與抗壞血酸含量的變化呈極顯著正相關（P<0.01）。DPPH 自由基清除率、pH 均與花色苷含量的變化呈極顯著正相關（P<0.01），TSS 與花色苷含量的變化呈顯著正相關（P<0.05）。pH 與TSS質量分數的變化呈極顯著正相關（P<0.01）。TA 含量與花色苷含量、pH、TSS質量分數、抗壞血酸含量的變化呈顯著負相關（P<0.01），DPPH 自由基清除率與總酸含量的變化呈顯著負相關（P<0.05）。

表1 R7 發酵獼猴桃汁各項指標的相關性分析Tab.1 Correlation analysis of indexes of kiwifruit fermentation juice

對獼猴桃汁的R7 組不同發酵時間和各項指標進行分析，結果見表2。發酵獼猴桃汁的總酚含量第0 天和第20 天不顯著，其余均有顯著性差異。抗壞血酸在第0 天和第4 天、第12 天和第16 天、第20 天和第24 天的含量差異不顯著。花色苷含量、pH、TSS 質量分數、TA 含量從發酵開始到發酵結束均有顯著性差異。DPPH 自由基清除率第12 天和第16 天差異不顯著，其余時間均有顯著性差異。

表2 R7 發酵獼猴桃汁各項指標的顯著性分析Tab.2 Significance analysis of various indexes in kiwifruit fermentation juice

3 結論

本試驗用自然發酵、3 種乳酸菌單獨發酵以及這3 種乳酸菌按照1∶1 復配發酵的形式發酵獼猴桃汁，得到了7 組發酵汁。在整個發酵過程中，因為添加的菌種不同，發酵獼猴桃汁產生的氣味，以及測定的指標結果都不相同。與自然發酵相比，乳酸菌能夠利用糖類物質進行代謝，促進TSS的分解，從而提高TSS 的轉化利用率，也能促進乳酸的產生，使得pH 降低，使得發酵獼猴桃汁的TA 含量升高。在整個發酵期間，由于乳酸的產生，TSS 質量分數呈下降趨勢，使得總酚含量、抗壞血酸含量、花色苷含量和DPPH 自由基清除率呈下降狀態，乳酸菌發酵獼猴桃汁可使TA 含量增加到3.04 mg/L，總酚含量能保持在90.66 mg/100 mL，抗壞血酸含量能達到0.136 mg/L，花色苷含量保持在26.79 mg/L。通過相關性分析可知，發酵獼猴桃汁的花色苷含量、DPPH 自由基清除率、pH、TSS 質量分數均與抗壞血酸的變化呈顯著正相關（P<0.01）。DPPH 自由基清除率、pH 均與花色苷含量的變化呈顯著正相關（P<0.01），TSS 質量分數與花色苷含量的變化呈顯著正相關（P<0.05）。pH 與TSS 質量分數的變化呈顯著正相關（P<0.01）。TA 與花色苷含量、pH、TSS 質量分數、抗壞血酸的變化呈顯著負相關（P<0.01），DPPH 自由基清除率與TA 的變化呈顯著負相關（P<0.05）。與自然發酵相比，添加乳酸菌的發酵獼猴桃汁品質更佳，其中保加利亞乳桿菌與干酪乳桿菌的復配對獼猴桃汁的發酵效果最好，適用于獼猴桃汁的發酵，為獼猴桃汁加工提供了一定的參考依據。