胃癌組織中趨化素樣因子超家族8蛋白表達與胃癌上皮-間質轉化關系及臨床意義

閆 萌,張 征,邢保健,張 鵬,李潤婷,朱小年

(1.保定市第一中心醫(yī)院普通外三科,河北 保定 071000;2.保定市第二醫(yī)院婦科,河北 保定 071000;3.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院流行病學與統計學系,廣西 桂林 541000)

胃癌(Gastric carcinoma,GC)是消化系統最常見惡性腫瘤之一,是全球第五大常見惡性腫瘤和第三大癌癥相關死亡原因,病死率位居首位。手術是目前臨床根治胃癌的唯一方法,其可通過對腫瘤組織及其鄰近受到腫瘤細胞侵襲的組織進行切除,進而實現對腫瘤細胞及組織的清除[1-2]。盡管其綜合治療的效果顯著提高,但胃癌的高侵襲轉移特點導致患者的臨床治愈率和長期生存率仍然很低。上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一種細胞生物學過程,其中上皮細胞通過特定程序下調上皮特征后獲得間充質表型[3-4]。EMT與惡性腫瘤發(fā)生進展關系密切,為開發(fā)潛在的治療靶點提供思路。E-cadherin、Vimentin和N-cadherin 是較為常用的EMT 相關基因。E-cadherin參與同型細胞間的黏附連接,在維持細胞形態(tài)及極性中具有重要作用,是一種經典的上皮細胞標志物;Vimentin是細胞骨架蛋白中的一種,廣泛分布于各種內皮細胞、成纖維細胞等間質細胞中,在維持間質細胞形態(tài)、調節(jié)細胞黏附分子中起到重要作用;N-cadherin蛋白表達可促進腫瘤的浸潤與轉移[5]。趨化素樣因子超家族8(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing,CMTM8)作為含有 MARVEL 跨膜結構域的趨化素樣因子超家族成員[6],在包括肝臟、肺、結直腸、胃、食管等多種實體瘤中表達下調[7],并參與腫瘤的侵襲轉移過程。最新研究[8-9]表明,CMTM8通過激活Wnt-β-catenin信號通路,誘導腫瘤EMT過程。而CMTM8與胃癌EMT表型的關系尚未見報道,本研究通過分析CMTM8與EMT在胃癌組織中的表達,進而探討CMTM8與EMT之間的關系及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集78例保定市第一中心醫(yī)院2014年1月至2020年5月通過病理確診為胃癌患者的胃癌組織和相應癌旁5 cm以上的正常胃黏膜組織。所有患者術前均未接受任何放療或化療。從患者病歷中收集完整臨床信息,并記錄自手術日期到死亡日期或最后一次隨訪的生存時間。病例納入標準:符合《胃癌規(guī)范化診療指南(試行)》中診斷表標準[10];有完整的臨床資料;排除標準:合并腎間質、肝、肺纖維化者;有并發(fā)其他腫瘤者;心、腎功能不全者。本研究通過保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 試 劑 CMTM8兔抗人多克隆抗體購自Proteintech公司(15039-1-AP),E-cadherin、Vimentin和 N-cadherin兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物公司; 免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色劑及 GAPDH 鼠抗人單克隆抗體均購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化法檢測CMTM8在胃癌與癌旁正常組織中的表達 胃組織蠟塊標本制成5 μm厚的組織切片,采用免疫組化染色間接染色法按試劑盒說明書進行免疫組化染色。一抗包括CMTM8(1∶150),E-cadherin(1∶300),Vimentin(1∶300),N-cadherin(1∶300)。結果判定:為了評估CMTM8表達,隨機選擇每個標本中的5個區(qū)域,并在顯微鏡下計數>500個細胞,以確定免疫染色細胞的平均百分比。按陽性細胞染色百分比劃分為5個等級:無陽性細胞為0分,陽性細胞數占6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,大于75%為4分。根據染色強度劃分為4個等級:無染色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。最后將兩項得分相加之和作為CMTM8最終染色得分:>4分定為CMTM8陽性,≤4分定為CMTM8陰性。E-cadherin>50%的細胞呈棕黃色為陽性; Vimentin>10%的細胞呈棕黃色顆粒為陽性;N-cadherin>10%的細胞呈棕黃色為陽性。

1.4 Western blot法檢測CMTM8、EMT標志蛋白在胃癌與癌旁正常組織中的表達 在新鮮的胃癌組織中加入RIPA裂解液后提取組織中的總蛋白,采用 BCA 法測定組織樣品中的蛋白表達。將總蛋白置于10%的SDS-PAGE中進行電泳,分離的蛋白質轉移至PVDF膜后以5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別孵育一抗 CMTM8(1∶1000),4 ℃過夜。次日以相應的辣根過氧化物酶標記的二抗 ( 1∶1500) 室溫孵育 2 h,用 ECL 發(fā)光并拍照。結果用 Image J 軟件進行條帶灰度值測定,以與內參GAPDH( 1∶1500) 的比值作為各指標的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行統計學分析。計數資料以例數表示,采用χ2檢驗;用Pearson相關檢驗CMTM8蛋白表達水平與胃癌患者臨床病理特征之間以及EMT標志蛋白之間的相關性;采用Kaplan-Meier法進行生存分析;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CMTM8蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 Pearson相關檢驗表明,患者的性別、年齡、家族史、腫瘤直徑、糖鏈抗原199(CA199)、血清癌胚抗原(CEA)、漿膜侵犯、淋巴結轉移與CMTM8表達無相關性(r=0.071、3.375、1.012、1.928、0.002、0.238、0.347、0.039,P=0.790、0.066、0.314、0.165、0.964、0.626、0.556、0.843),患者的疾病分化程度、TNM分期、發(fā)生遠處轉移與CMTM表達呈正相關(r=4.136、5.285、5.309,P=0.042、0.022、0.021);胃癌組織中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的陽性率分別為:30.8%、34.6%和61.5%;CMTM8與E-cadherin表達呈正相關(r=0.242,P=0.006),與Vimentin和N-cadherin表達呈負相關(r=-0.285、-0.332,P=0.002、0.026)。見表1。

表1 CMTM8表達與胃癌患者臨床病理特征的關系(例)

2.2 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜組織中的表達比較 免疫組化結果顯示,CMTM8主要定位于細胞膜和細胞質中(圖1)。胃癌組織中CMTM8的陽性率(29.49%,23/78),明顯低于癌旁正常黏膜組織(61.54%,48/78)(P<0.01),見表2。

圖1 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜組織中的表達(免疫組化染色,×400)

表2 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜組織中的表達(例)

2.3 CMTM8與EMT標志蛋白在胃癌組織和正常黏膜組織中的表達比較 胃癌組織中,CMTM8蛋白和E-cadherin蛋白表達水平低于癌旁正常黏膜組織,差異有統計學意義(均P<0.05);胃癌組織中Vimentin、N-cadherin蛋白表達水平高于癌旁正常黏膜組織,差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖2。

A:CMTM8蛋白表達情況;B:E-cadherin蛋白表達情況;C:Vimentin蛋白表達情況;D:N-cadherin蛋白表達情況;與癌旁正常黏膜組織比較,*P<0.05

2.4 CMTM8蛋白表達與胃癌患者預后的關系 根據免疫組化結果,將78例胃癌患者分為陽性表達組和陰性表達組,以探討其與預后的關系。CMTM8陽性表達和陰性表達的胃癌患者中位生存時間分別為61個月(95%CI:50.80～71.55)、41個月(95%CI:33.28～49.60),對數秩檢驗后發(fā)現,CMTM8陰性表達組胃癌患者預后差于陽性表達組胃癌患者(P<0.05)。

3 討 論

在腫瘤細胞中,EMT的發(fā)生往往導致細胞惡性生物學行為增強,EMT過程使正常細胞和癌細胞之間失去細胞間連接、上皮與基質間黏附、正常上皮細胞極性,從而獲得間質細胞特性[11]。而胃癌發(fā)生侵襲轉移與胃癌細胞發(fā)生EMT密切相關。其特點是上皮標記物E-cadherin表達下調,間質標記物Vimentin、N-cadherin表達上調[12]。因此,對EMT相關分子的研究將可能對胃癌的治療及改善預后起到重要作用。

CMTM8是新近發(fā)現的新型人類趨化性細胞因子,其表達產物為4次跨膜蛋白并具有MARVEL結構域,其過表達可通過減弱EGFR介導的信號傳導,加速EGFR從細胞表面的內化,進而影響細胞增殖[13]。CMTM8及其剪接變異體CMTM-V2(缺少由外顯子2編碼的MARVEL結構域和細胞質的YXX基序)通過半胱天冬依賴和非依賴的途徑誘導多個腫瘤細胞系凋亡[14]。

CMTM8在腫瘤中的作用使其成為近年來的研究熱點。先前的研究[15-17]已經發(fā)現,CMTM8在卵巢癌和腦轉移性三陰乳腺癌中低表達,并且在骨肉瘤中確定為新的候選抑癌基因。在膀胱癌中,低表達的CMTM8與較晚的TNM分期和腫瘤分級相關,提示預后不良,而過表達的CMTM8可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[18-19]。本課題結果表明,CMTM8在胃癌中的表達低于癌旁正常胃黏膜組織,并與胃癌患者的分化程度、TNM分期和遠處轉移顯著相關,且有遠處轉移的胃癌組中CMTM8蛋白表達水平低于無遠處轉移組。此外,我們還發(fā)現低表達的CMTM8提示胃癌患者預后不良。胡浩等[20]報道,CMTM8在低級別腎透明細胞癌的細胞膜上表達強度明顯下降,在高級別腎透明細胞癌的細胞膜上表達強度進一步減弱,同時其肺轉移及骨轉移組織中細胞膜表達水平持續(xù)下降,提示CMTM8與腎透明細胞癌的進展和轉移呈顯著負相關。以上研究結果與本組實驗結果相一致,提示CMTM8表達下降可能對胃癌的發(fā)生和轉移有促進作用。既往文獻[21]報道,上調的CMTM8可以通過HGF/c-MET/ERK信號傳導通路抑制ERK-MAPK通路的激活,從而抑制HepG2肝癌細胞的EMT過程,進而使肝癌細胞遷移、侵襲能力減弱。Shi等[8]報道,CMTM8與溶血磷脂酸(LPA)之間的相互作用導致Wnt-β-catenin信號傳導通路的激活,并因此誘導胰腺癌的EMT過程,這使CMTM8被認為是LPA誘導胰腺癌侵襲的關鍵因素。在一項結腸癌的研究中發(fā)現,CMTM8與上皮相關標志物TJP1呈負相關,與間充質相關標志物如MMP3、MMP7、MMP9呈正相關[22]。

綜上所述:本研究在胃癌組織水平研究了CMTM8表達與EMT標志蛋白表達的關系,結果表明:CMTM8與E-cadherin表達呈正相關,與Vimentin和N-cadherin表達呈負相關;進一步Western blot檢測發(fā)現,CMTM8高表達的胃癌組織中,E-cadherin同樣高表達,而Vimentin和N-cadherin低表達,反之亦然,這表明CMTM8參與胃癌的EMT過程,其低表達促進了胃癌的侵襲轉移。值得注意的是,本研究雖然與其在結腸癌中的結果不一致,但這充分說明了CMTM8乃至其家族功能的復雜性,可能對不同類型腫瘤細胞產生積極或消極的影響。有關CMTM8的研究尚處于起步階段,探討其與胃癌EMT的關系有助于揭示胃癌的發(fā)生、發(fā)展機制,使其有望成為胃癌診斷和治療的潛在靶點。