轉基因玉米MON87427梯度含量基體標準物質的研制

李俊，單露英，肖芳，李允靜，高鴻飛，翟杉杉，吳剛，張秀杰，武玉花

轉基因玉米MON87427梯度含量基體標準物質的研制

1中國農業科學院油料作物研究所/農業農村部農業轉基因生物溯源重點實驗室，武漢 430062；2農業農村部科技發展中心，北京 100025

【目的】轉基因檢測標準物質是轉基因生物安全監管、標識制度實施的物質基礎，是實驗室內檢測數據溯源、實驗室間檢測數據可比的保證。中國于2017年批準進口轉基因玉米MON87427用作加工原料，其安全監管和檢測急需研制有證標準物質。【方法】以開發商提供的轉基因玉米MON87427雜合種子和非轉基因受體種子為原材料，對轉基因玉米MON87427和其受體種子分別清洗、干燥、冷凍研磨、粒徑及含水量檢測，按質量分數（以干基計）稱量配制得到質量分數分別為60.0、99.5和1 000.0 mg·g-1的轉基因玉米MON87427基體標準物質MON87427a、MON87427b和MON87427c。運用實時熒光定量PCR進行粉末的均勻性初檢，初檢合格后分裝。用MON87427/二重微滴數字PCR（ddPCR）方法進行標準物質均勻性、穩定性評估和8家實驗室聯合定值。根據《標準物質定值的通用原則及統計學原理》（JJF 1343）進行標準物質均勻性評估、穩定性評估、聯合定值數據的處理及不確定度評定。【結果】本批標準物質有MON87427a、MON87427b、MON87427c 3個濃度，粒徑小于200 μm的粉末大于80%，含水量低于5%。用棕色玻璃瓶分裝，不低于1.0 g/瓶，充氮后軋蓋，3個濃度的標準物質各分裝400瓶。3種標準物質均勻性檢驗的值均小于臨界值0.05(14,30)（2.04），在瓶內和瓶間具有良好的均勻性，使用時，最小取樣量為100 mg。標準物質在25℃、37℃和60℃條件下可穩定儲存14 d，表明在常溫下運輸14 d標準物質特性量值不發生趨勢性變化；在4℃和-20℃條件下長期穩定性達到12個月；開蓋取樣5次，標準物質特性量值未發生顯著偏離。8家實驗室聯合測定的標準物質拷貝數比值無異常值、呈正態分布、且等精度，標準物質MON87427a、MON87427b、MON87427c的標準值及擴展不確定度分別為（2.92±0.44）%、（4.89±0.57）%、（52.1±3.4）%。【結論】研制的轉基因玉米MON87427梯度含量基體標準物質均勻性良好，可穩定運輸和儲存，滿足轉基因玉米MON87427定性、定量檢測需求，為轉基因玉米MON87427的安全監管、定量標識制度的實施提供了可靠的有證標準物質。

轉基因玉米MON87427；基體標準物質；二重微滴數字PCR；特性量值；不確定度

0 引言

【研究意義】標準物質和文本標準共同構成完整的標準體系。標準物質是文本標準實施的物質基礎，是確保檢測結果準確、可靠、可比、可溯源的前提[1]。研制轉基因檢測標準物質是實施轉基因檢測標準、落實定量標識制度、保障轉基因生物安全、貫徹黨中央“尊重科學、嚴格監管，有序推進生物育種產業化應用”指示精神的迫切需要。【前人研究進展】1996年批準首個轉基因作物商業化后，轉基因作物在世界范圍內被廣泛種植和應用，為了保護消費者的知情權，絕大多數國家實施轉基因產品標識制度。轉基因生物安全管理和標識制度的實施需要有轉基因檢測標準物質和檢測標準[2]。歐盟委員會聯合研究中心（Joint Research Center，JRC）下屬的標準物質和測量研究所（Institute of Reference Materials and Measurement，IRMM）率先在歐盟委員會資助下研制轉基因標準物質，于2004年與英國政府化學家實驗室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）、德國聯邦材料研究和測試研究所（Bundesanstalt für Materialforschung und-prüfung，BAM）合作推出歐洲標準物質（European Reference Materials，ERM）系列轉基因標準物質。2016年聯合研究中心重組，IRMM更名為F局“健康、消費者和標準物質”（Directorate F-"Health, Consumers and Reference Materials"），繼續從事轉基因標準物質的研制和生產。歐盟發布的轉基因標準物質主要有基體標準物質和質粒標準物質2種類型。一組轉基因基體標準物質通常由標稱轉基因質量分數為0、0.1%、1%、10%和100%（m/m）的有證標準物質組成[3]。但轉基因土豆或轉基因甘蔗標準物質通常只有0和100% 2個質量分數[4-5]。到2022年，歐盟發布了147種轉基因檢測基體標準物質，涵蓋了歐盟批準的35個轉基因品種；研發的質粒標準物質只有轉基因大豆356043、轉基因玉米MON810、NK603、98140[6]。在美國，轉基因檢測標準物質由油脂化學家學會（American Oil Chemists’ Society，AOCS）研制和發布。AOCS發布的轉基因標準物質主要為純品粉末或純品基因組DNA，以純度賦值，量值不確定度忽略。目前共發布了66個標準物質，包括21個基因組DNA標準物質和45個粉末標準物質，涵蓋轉基因油菜、棉花、玉米、馬鈴薯、水稻、大豆和甜菜7個作物[7]。AOCS生產銷售的轉基因標準物質沒有提供標準值的不確定度，原則上達不到量值溯源的要求，不屬于有證標準物質。除了歐盟和美國，日本研發了一些質粒標準物質，用作PCR反應的陽性對照。中國已批準64個轉基因作物品種進口到中國用作加工原料，包括22個轉基因玉米、20個轉基因大豆、11個轉基因棉花、9個轉基因油菜、1個轉基因甜菜和1個轉基因番木瓜。在轉基因重大專項的資助下，中國也自主研發了大量轉基因產品，目前已有轉基因水稻華恢1號、轉基因玉米瑞豐12-5、DBN9936、DBN9858、DBN9501、轉植酸酶玉米、轉基因大豆DBN9004、中黃6106、SHZD3201等多個轉基因品種獲得生物安全證書，即將開啟商業化應用。為轉基因生物安全監管，農業農村部發布了124項現行有效轉基因成分檢測標準。與發布的檢測標準相比，目前，中國僅發布了47個有證標準物質，包括34個基體標準物質、5個基因組DNA標準物質、8個質粒標準物質，涵蓋轉基因水稻Bt63、TT51-1、克螟稻、科豐6、G6H1，轉基因玉米NK603、MON87427、雙抗12-5、T25、MIR604、MON863、Bt11，轉基因大豆MON89788、MON87751、GTS40-3-2等轉基因品種[8-13]。【本研究切入點】與發布的檢測標準相比，現行有證標準物質僅能配套少量定性定量檢測標準，有證標準物質存在巨大的缺口，不能有效支撐中國定量標識制度的落地實施。前期發布的轉化體標準物質大部分只有一個濃度，僅能滿足熒光定量PCR的校準需求。而在定量檢測過程中，不僅需要校準品，還需要進行測量偏倚控制的質控品，而且校準品和質控品不能為同一個標準物質[14-16]。急需研制轉基因產品的梯度含量標準物質，同時滿足定量檢測的校準和偏倚控制需求。中國于2017年批準轉基因玉米MON87427的進口，同年發布了《耐除草劑玉米MON87427及其衍生品種定性PCR方法》標準[17]，為轉基因玉米MON87427的安全監管提供了標準化方法。但轉基因玉米MON87427的安全監管及標準化方法的應用需要有準確量值的標準物質。【擬解決的關鍵問題】本研究擬研制轉基因玉米MON87427梯度含量基體標準物質，將進一步完善轉基因玉米基體標準物質制備的技術平臺，為轉基因玉米MON87427的定量檢測提供有準確量值的校準品和陽性定量質控品，保證各實驗室間檢測數據的準確性和可比性，為轉基因定量標識制度的實施提供物質保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

標準物質原材料用孟山都公司提供的轉基因玉米MON87427雜合種子和對應受體非轉基因玉米種子。

1.2 DNA提取

用植物基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen公司，德國）提取玉米種子粉末的基因組DNA，粉末用量100—200 mg。提取的基因組DNA用90 μL 0.1×TE（Tris-EDTA）緩沖液溶解。用紫外分光光度法（Nanodrop 1000，Nanodrop，美國）檢測基因組DNA溶液的濃度，并根據OD260/280的比值評估基因組DNA的質量。2020年，在農業農村部科技發展中心實驗室提取原材料基因組DNA；2021年，在中國農業科學院油料作物研究所實驗室提取標準物質基因組DNA。

1.3 原材料鑒定

2020年，在農業農村部科技發展中心實驗室進行原材料鑒定。采用四分法抽取轉基因玉米MON87427種子300粒，單粒種子提取基因組DNA；抽取非轉基因玉米3 000粒種子，混合研磨，提取基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，用轉化體特異性和插入位點特異性普通PCR方法進行基因型鑒定；用MON87427轉化體特異性和內標基因熒光PCR方法[18-19]，進行純度鑒定。實時熒光定量PCR方法的引物、探針序列見表1。反應體系為10 μL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix（Bio-rad）、0.8 μL上下游引物（10 μmol·L-1）、0.4 μL探針（10 μmol·L-1）、2.0 μL基因組DNA，加ddH2O至20 μL。在CFX96熒光定量PCR儀（Bio-rad）上進行反應，反應程序為95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 60 s，45個循環。用軟件CFX Manager ? ver. 1.6（1.6.541.1028）讀取數據。普通PCR反應體系為12.5 μL 2×reaction Mix、1.0 μL上下游引物（10 μmol·L-1）、0.3 μL Golden DNA Polymerase（2.5 U·μL-1）、2.0 μL基因組DNA，加8.2 μL ddH2O至25 μL。在C1000 PCR儀（Bio-rad）上進行反應，反應程序為94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，35個循環；72℃ 5 min。對PCR產品進行凝膠電泳，在凝膠成像系統（JY04S-3C，JUNYI）上成像檢測。

表1 PCR引物、探針序列及擴增片段大小

1.4 標準物質制備

2020年，在農業農村部科技發展中心實驗室進行標準物質制備。干燥后的轉基因和非轉基因玉米種子用冷凍研磨系統（SPEX 6870）進行研磨，研磨程序為預冷2 min，研磨3 min，冷卻2 min，3個循環。研磨后將種子粉末用震動分篩機（8411型，浙江省上虞市公路儀器廠）過篩，用校準天平稱量不同粒徑粉末的質量，檢測粉末粒度大小分布。轉基因粉末和非轉基因粉末用真空冷凍干燥系統（Labconco Freezone）干燥48 h。從轉基因粉末和非轉基因粉末中分別取5份樣品，每份2 g，進行粉末含水量測定（DSH-50A-1，上海佑科儀器儀表有限公司）。將含水量和原材料候選物純度等因素考慮在內，計算配比干基轉基因粉末質量分數為60和100 mg·g-1的混合粉末應稱取的轉基因粉末和非轉基因粉末的質量。根據計算結果，使用校準的感量為1 mg的精密分析天平，準確稱量轉基因玉米MON87427種子粉末和非轉基因玉米種子粉末。將稱量的2種粉末混在一起，利用固體粉末混合儀（科勒，YG-2L）混合24 h以上，充分混勻，混合樣品分別命名為MON87427a和MON87427b。將轉基因粉末直接分裝，制備MON87427c。

1.5 均勻性初檢

2020年，在農業農村部科技發展中心實驗室進行標準物質均勻性初檢。在轉基因玉米粉末和非轉基因玉米粉末混勻過程中取樣進行均勻性初檢，在混勻12、18和24 h各取樣一次。每次取樣選不同的部位取樣9份，每份100 mg。提取基因組DNA后，用MON87427轉化體和玉米內標基因熒光定量PCR方法進行檢測[18-19]，MON87427轉化體和玉米內標基因的熒光定量PCR反應體系相同，反應體系和程序見1.3，引物/探針序列見表1。依據《標準物質定值的通用原則及統計學原理》（JJF1343）[20]，對均勻性初檢數據進行單因素方差分析，計算統計量，并與臨界值比較，判斷標準物質的均勻性。

1.6 均勻性檢驗

2020年，在中國農業科學院油料作物研究所實驗室進行標準物質均勻性檢驗。每種標準物質隨機抽取15瓶，每瓶取3個子樣，每個子樣100 mg，每種標準物質取45個子樣。提取各子樣的基因組DNA，用MON87427/二重微滴數字PCR（ddPCR）檢驗標準物質的均勻性。MON87427/二重ddPCR已在前期研究中優化確認[21]，引物和探針見表1。20 μL反應體系為10 μL 2×ddPCR supermix、0.8 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.8 μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.4 μL探針（10 μmol·L-1）、1 μL DNA模板和5 μL ddH2O，MON87427轉化體和內標基因引物/探針濃度相同。反應程序為95℃ 10 min；94℃ 30 s，58.4℃ 1 min，50個循環；98℃ 10 min，升降溫速度2℃·s-1；4℃保存，降溫速度1℃·s-1。反應結束后，將96孔板平緩地放入微滴讀取儀（QX200 droplet reader，Bio-rad）中收集微滴信號，采用QuantaSoft Version 1.7.4.0917軟件讀取數據。數據分析依據及方法同均勻性初檢。

1.7 穩定性檢驗

2020—2021年，在中國農業科學院油料作物研究所實驗室進行標準物質穩定性檢驗。穩定性檢驗包括短期穩定性（運輸穩定性）、長期穩定性、開蓋穩定性檢驗，均用建立的MON87427/二重ddPCR進行檢驗，二重ddPCR反應體系和程序見1.5。短期穩定性檢驗設置3個溫度25℃、37℃和60℃，標準物質在每個溫度分別放置0、3、7和14 d，3個溫度下在每個時間點取樣1瓶。長期穩定性檢驗設置2個溫度4℃和-20℃，標準物質在每個溫度分別放置0、1、2、4、6和12個月，每個溫度點和時間點各取樣1瓶。開蓋穩定性檢驗每個濃度取2瓶標準物質，設5個不同的開蓋時間點，每次開蓋從每瓶標準物質中取2個子樣，每個子樣100 mg，共進行5次開蓋操作。取出的樣品統一放置在-20℃冰箱中，待所有樣品取出后，采用同步穩定性評估方案在重復條件下進行檢測，每瓶樣品提取3份基因組DNA進行檢驗。依據《標準物質定值的通用原則及統計學原理》（JJF 1343）[20]，對短期穩定性和長期穩定性檢驗數據繪制特性值隨時間變化曲線的線性模型（=0+1），根據擬合曲線的斜率是否顯著，判斷特性值在儲存周期內是否穩定。對開蓋穩定性檢驗數據進行檢驗，考察第一次開蓋檢測數據與后續開蓋檢測數據間是否存在顯著差異。

1.8 標準物質聯合定值

2021年，組織8家有資質的實驗室利用MON87427/二重ddPCR方法對標準物質的特性量值進行聯合測定。每家實驗室分發每個濃度標準物質2瓶，每瓶標準物質重復檢測4次。檢測完成后，將數據反饋給組織方匯總。依據《標準物質定值的通用原則及統計學原理》（JJF 1343）[20]，對聯合定值數據處理，先后進行實驗室內異常值檢驗、數據正態分布檢驗、實驗室間異常值和等精度檢驗。

1.9 數據處理及不確定度評定

2 結果

2.1 標準物質制備

對標準物質原材料轉基因玉米MON87427種子和對應非轉基因玉米種子進行純合度和純度鑒定。結果表明，轉基因玉米MON87427籽粒均為雜合種子；抽300粒種子進行單粒檢測，MON87427轉化體PCR均為陽性，在95%的置信度下其純度≥99.01%；抽取3 000粒非轉基因玉米種子進行混合檢測，MON87427轉化體PCR為陰性，在95%的置信度下其純度≥99.9%。

2.1.1 粉末粒度和含水量檢測 對轉基因玉米MON87427籽粒和非轉基因玉米籽粒冷凍研磨后，檢測轉基因和非轉基因粉末的粒徑分布，轉基因玉米粉末顆粒度小于200 μm的顆粒占81.73%，對應非轉基因玉米粉末顆粒度小于200 μm的顆粒占81.79%。2種原材料粒徑小于200 μm的粉末均占80%以上，顆粒度相似，且與歐盟制備的粉末標準物質的粒度相近[3]，滿足高效提取基因組DNA的要求。將粉末冷凍干燥后，分別測定轉基因粉末和非轉基因粉末含水量。轉基因玉米MON87427粉末含水量（1.08±0.25）%，非轉基因玉米粉末含水量（1.10±0.34）%，二者含水量相近，且低于標準規定的10%[22]。

2.1.2 配比混合 擬制備3種不同轉基因含量的基體標準物質，分別為MON87427a、MON87427b和MON87427c，對應的轉基因粉末質量分數依次為60、100和1 000 mg·g-1。標準物質MON87427a和MON87427b需通過混合轉基因粉末和非轉基因粉末配制，MON87427c通過直接分裝轉基因玉米MON87427粉末制備。MON87427a和MON87427b均配制總重量為450 g的混合粉末，將轉基因粉末和非轉基因粉末含水量考慮在內，計算需稱取的轉基因粉末和非轉基因粉末質量（表2）。使用校準的感量為1 mg的精密分析天平實際稱量27.005 g轉基因粉末和422.997 g非轉基因粉末，充分混合，制備質量分數為60.02 mg·g-1的標準物質MON87427a；稱取44.778 g轉基因粉末和405.222 g非轉基因粉末，充分混合，制備質量分數為99.52 mg·g-1的標準物質MON87427b9（表2）。

2.1.3 均勻性初檢 在混勻過程中對標準物質取樣進行均勻性初檢。用實時熒光定量PCR檢測每份樣品中MON87427轉化體與內標基因的拷貝數比值。對所有抽取樣品的測試數據進行單因素方差分析，計算不同時間點抽取樣品的統計量值（表3）。結果表明，3個濃度梯度標準物質在混合12、18和24 h后，其統計量值均小于臨界值0.05(8,18)（2.51），表明標準物質在混合12 h后，從不同位置抽取的樣品，其特性值無顯著差異，粉末混合均勻，可進行分裝。

表2 制備標準物質MON87427a和MON87427b稱取的轉基因粉末和非轉基因粉末質量

表3 MON87427標準物質的均勻性初檢結果

2.1.4 分裝 用電子天平稱取不少于1.0 g的粉末置于棕色玻璃瓶中，充氮氣、加塞，壓蓋。MON87427a、MON87427b、MON87427c 3種標準物質分別分裝400瓶。

2.2 均勻性評估

從每種標準物質中隨機選取15瓶，每瓶取3份子樣提取DNA。采用MON87427/二重ddPCR方法檢測每份樣品中MON87427/的拷貝數比值。對檢測數據進行檢驗，計算3種標準物質的統計量。標準物質MON87427a的統計量為1.70、MON87427b的統計量為1.40、MON87427c的統計量為1.63（表4）。3種標準物質的統計量都小于臨界值0.05（14,30）（2.04），表明制備的3種標準物質的特性值在瓶內和瓶間無顯著差異，均勻性良好。

表4 MON87427標準物質的均勻性方差分析結果

根據發布的轉基因產品DNA提取和純化標準[23-24]，提取DNA的最小取樣量不少于100 mg。以100 mg MON87427標準物質粉末作為原料提取基因組DNA，獲取的基因組DNA足夠后續繪制標準曲線或用作質控對照。取樣100 mg粉末進行標準物質的均勻性評估，MON87427a、MON87427b、MON87427c 3個基體標準物質均顯示良好的均勻性，且均勻性評估測量程序的重復性標準偏差均小于標準物質物質標準不確定度的1/3。100 mg取樣量能獲得可接受精密度的測量結果，因此，本批標準物質的最少取樣量為100 mg。

2.3 穩定性評估

基體標準物質的運輸溫度在冬季通常會超過20℃，夏季超過30℃，在太陽照射下甚至會達到60℃。在短期穩定性評估中，設定標準物質的儲存溫度為25℃、37℃和60℃。計算25℃、37℃和60℃條件下，各標準物質MON87427/的拷貝數比值隨儲存時間變化曲線（=0+1）的斜率1，及斜率1的標準偏差(1)（表5）。-檢驗（自由度=-2）結果顯示各回歸曲線的斜率不顯著，即|1|<0.95n-2·(1)。檢驗結果表明，3個基體標準物質在25℃、37℃和60℃條件下儲存，特性值未隨儲存時間的延長表現出明顯的趨勢性變化。因此，3個基體標準物質可在常溫（25℃—37℃）乃至極端高溫60℃條件下穩定運輸14 d。

表5 MON87427標準物質的短期穩定性評估結果

基體標準物質通常在冰箱冷藏或冷凍條件下長期儲存，在長期穩定性評估中，設定標準物質的儲存溫度為4℃和-20℃。繪制4℃和-20℃條件下，標準物質特性值隨儲存時間的變化曲線（圖1）。3個濃度的基體標準物質在不同的溫度下儲存12個月，特性量值未隨著儲存時間的延長發生單方向變化。-檢驗表明各回歸曲線的斜率1不顯著，3個濃度的基體標準物質在4℃和-20℃條件下均可穩定儲存12個月以上，特性量值不發生顯著變化。

標準物質在使用過程中存在多次使用多次開蓋的問題，開蓋操作會令標準物質粉末吸潮，可能影響標準物質的穩定性，故對本批標準物質進行了開蓋穩定性檢測。采用檢驗法分別比較第2—5次開蓋樣品的拷貝數比值測量值與第一次開蓋樣品拷貝數比值測量值間的一致性。計算的值均小于臨界值(0.05,6)，結果表明，第2—5次開蓋操作并未導致標準物質的拷貝數比值測量值顯著偏離第一次開蓋標準物質的測量值（表6）。因此，本批標準物質在使用過程中可開蓋5次。

2.4 聯合定值及數據處理

8家實驗室均按統一的定值程序在規定時間內完成了標準物質的定值，并反饋了蓋章的定值結果。用狄克遜法和格拉布斯法分別檢驗8家實驗室3個濃度標準物質的定值數據，未發現實驗室內異常數據；用達戈斯提諾法對聯合定值數據進行正態性分布檢驗，當置信概率為95%時，統計值均落在達戈斯提諾法檢驗臨界區間，接受8家實驗室對3個濃度標準物質的聯合定值數據為正態分布；用狄克遜準則對3個標準物質的8家實驗室定值數據平均值進行統計檢驗，未發現異常平均值；采用科克倫法檢驗3個標準物質的8家實驗室間定值數據平均值是否等精度，統計量值均小于臨界值(0.05,8,8)，表明8家實驗室定值數據平均值間為等精度。聯合定值的數據實驗室內和實驗室間均無異常值，實驗室間數據等精度，且定值數據呈正態分布，定值數據符合標準JJF 1343的要求。計算定值數據的總平均值，作為標準物質特性量值拷貝數比值的標準值（表7）。

圖1 標準物質MON87427a、MON87427b、MON87427c在4℃和-20℃放置不同時間轉基因含量的變化趨勢

表6 MON87427標準物質開蓋穩定性評估結果

表7 MON87427標準物質聯合定值結果統計分析

2.5 不確定度評定

標準物質的不確定度主要來源于均勻性引起的不確定度、穩定性引起的不確定度和定值過程帶來的不確定度。根據標準物質的均勻性評估和穩定性評估數據，分別評定均勻性相對不確定度（rel,bb）、短期穩定性相對不確定度（rel,ss）、長期穩定性相對不確定度（rel,ls）（表8）。

標準物質定值過程引入的不確定度c包括A類不確定度和B類不確定度2個部分。A類不確定度統計為8家實驗室定值數據總平均值的標準差，相對不確定度為相對標準差（表7）；B類不確定度通過對影響數字PCR測量準確性關鍵因素的分析，以非統計分析的方法進行評定。本批標準物質采用MON87427/二重ddPCR方法進行聯合定值，根據標準ISO 20395:2019（E）[22]，二重ddPCR測量的拷貝數比值的B類不確定度主要來源于數字PCR閾值線設定產生的不確定度。根據Deprez等[25]提供的方法，用MON87427/二重ddPCR動力學范圍測試的數據[21]，評定陽性微滴識別引入的不確定度。MON87427轉化體ddPCR陽性微滴識別引入的相對不確定度為0.687%，內標基因ddPCR陽性微滴識別引入的相對不確定度為0.542%，將二者合成為B類相對不確定度。將A類相對不確定度和B類相對不確定度合成為標準物質定值過程引入的相對不確定度rel,c（表8）。

表8 MON87427基體標準物質量值和不確定度

將均勻性相對不確定度（rel,bb）、短期穩定性相對不確定度（rel,ss）、長期穩定性相對不確定度（rel,ls）和定值相對不確定度（rel,c）4個分量合成標準物質的相對不確定度（rel,CRM）。在95%置信度下，取包含因子k=2，計算3個濃度標準物質標準值的擴展不確定度（表8）。3個濃度標準物質MON87427a、MON87427b、MON87427c的標準值及擴展不確定度依次表示為（2.92±0.44）%、（4.89± 0.57）%、（52.1±3.4）%。

3 討論

3.1 標準物質滿足定量檢測校準和質控的需求

中國即將推進生物育種產業化，急需出臺并實施轉基因產品的定量標識制度，設定定量標識閾值，對發生無意或低水平轉基因成分混雜的農產品、食品及飼料等豁免標識，在保障公眾知情權的前提下，降低標識成本，提升生物育種產業的經濟社會效益。轉基因檢測標準物質是進行定量標識和安全監管的物質基礎，立足中國的轉基因生物安全監管和標識需求，前期已研制了一批轉基因檢測有證標準物質。本著先易后難的原則，前期研制的主要是純品標準物質，包括轉基因玉米T25、MIR604、轉基因大豆MON89788、轉基因水稻科豐6號、克螟稻等，一個轉基因品種對應一種標準物質，能夠滿足轉基因產品定量檢測的校準需求[9-13]。但在轉基因定量檢測中，還需要轉基因含量與標識閾值相當的標準物質作為質控品，對檢測過程中的定量偏倚進行有效控制[14-15]。本研究在研制MON87427轉化體純品標準物質的基礎上，還研制了低濃度的標準物質，建立了梯度含量基體標準物質的研制程序，流程圖詳見圖2。

研制的本批標準物質充分考慮了定量檢測的實際需求，在研制純品標準物質MON87427c的基礎上，又研制了拷貝數比值標準值為2.92%和4.89%的低濃度標準物質MON87427a和MON87427b。中國還未正式出臺定量標識制度，定量標識閾值設定為3%還是5%尚未最終確定。無論將標識閾值設定為3%還是5%，都可用本批低濃度標準物質MON87427a或MON87427b作為定量檢測的質控對照，用純品標準物質MON87427c作為定量檢測的校準品繪制標準曲線。

圖2 質量分數標準物質研制流程圖

3.2 二重數字PCR提高了標準物質的定值準確性

特性量值準確、均勻、穩定是標準物質的基本特征。標準物質的均勻性評估、穩定性評估及定值都依賴于被確認的精準定量方法。數字PCR是一種不依賴于標準物質的核酸拷貝數絕對測量技術，已成為轉基因檢測標準物質定值的參考方法，并廣泛應用于標準物質的定值[26-27]。在同一反應體系中同步檢測外源基因和內標基因的二重ddPCR技術消除了外源基因和內標基因的取樣差異，被證明比單重數字PCR技術具有更高的定量準確性[28]。轉基因產品定量結果表示為外源基因和內標基因的拷貝數比值，根據標準ISO 20395:2019（E）[14]，二重ddPCR測量的外源基因和內標基因的拷貝數比值不受微滴體積和DNA模板稀釋倍數的影響，從而減少了定值結果的2個不確定度分量。與單重數字PCR相比，本批標準物質用MON87427/二重數字PCR進行標準物質的定值，定值結果具有更高的準確性和更小的定值不確定度。

4 結論

本批轉基因玉米MON87427基體標準物質有3個濃度，分別為MON87427a、MON87427b和MON87427c，標準值及擴展不確定度依次為（2.92±0.44）%、（4.89± 0.57）%、（52.1±3.4）%。3個濃度的標準物質均具有良好的均勻性和穩定性，特性量值準確可靠，滿足檢測機構對轉基因玉米MON87427進行定性、定量檢測的需求，為定量檢測校準和質控提供了可靠的有證標準物質，可有效保障各實驗室檢測數據的準確性、可靠性和可比性。

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Development of aset of matrix reference materials in different mass fractions of genetically modified maize MON87427

1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of agricultural genetically modified organism traceability, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062;2Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025

【Objective】The GMO (genetically modified organism) reference materials (RMs) are the material basis for GMO safety supervision and labeling policy implementation. During GMO detection the utilization of RMs guarantees the traceability of quantitative results within laboratory and the comparability of quantitative results between laboratories. GM (genetically modified) maize MON87427 has been approved to be imported as raw material in China, it’s urgent to develop certified reference materials (CRMs) for safety supervision and quantification. 【Method】The GM maize MON87427 hybrid seeds and non-GM counterparts provided by the developer were used as raw materials to perform washing, drying, freeze-grinding, particle size measurement, and moisture content measurement, sequentially. The matrix RMs of MON87427a, MON87427b and MON87427c were produced by blending the seed powder of the GM maize MON87427 and a non-GM counterpart in GMO mass fractions of 60.0 mg·g-1, 99.5 mg·g-1and 1 000.0 mg·g-1on a dry basis. The real-time quantitative PCR was used to conduct an initial assessment of homogeneity before packing. The MON87427/duplex digital PCR (ddPCR) was used to evaluate the homogeneity and stability of the RMs as well as the collaborative characterization by 8 qualified laboratories. The data processing of homogeneity, stability, collaborative characterization together with uncertainty evaluation of RMs were carried out according to the standard "General and Statistical Principles for Characterization of Reference Materials" (JJF 1343). 【Result】This batch of RMs contains three RMs of MON87427a, MON87427b, and MON87427c in different mass fractions, with more than 80% of particle size of less than 200 μm and less than 5% of moisture content. The RMs were packed in brown glass bottles, nitrogen flushed before capping, bottling amount was not less than 1.0 g/bottle, a total of 400 bottles were produced for each mass fraction RM. The calculatedvalues of the homogeneity test were all less than the critical value of0.05 (14, 30)(2.04) for the three RMs, displaying good homogeneity within and between bottles, and the minimum intake was determined to be 100 mg. The RMs can be stored stably at 25℃, 37℃, and 60℃ for 14 days, the property value of the RMs does not change significantly after 14 days of transportation at room temperature; the long-term stability can reach 12 months at 4℃ and -20℃; The property value of the samples taken from the same bottle of RM after 5 opening-capping cycles, does not deviate significantly from that of the first taken sample. The collaborative characterization data by eight qualified laboratories displayed normal distribution without outliers and outlying standard deviations. The standard value and expanded uncertainty of MON87427a, MON87427b, Mon87427c were certified to be (2.92±0.44)%, (4.89±0.57)%, (52.1±3.4)%. 【Conclusion】The developed GM maize MON87427 matrix RMs in different mass fractions have good homogeneity, and can be stably transported and stored. This batch of RMs meets the requirements of qualitative and quantitative detection of MON87427 event, providing reliable CRMs for the safety supervision and implementation of quantitative labeling policy for GMO-derived products.

genetically modified maize MON87427; matrix reference material; duplex digital PCR; property value; uncertainty

2022-10-28；

2022-12-08

轉基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08012-003）

李俊，E-mail：lijuner@caas.cn。通信作者張秀杰，E-mail：zhxj7410@sina.com。通信作者武玉花，E-mail：wuyuhua@oilcrops.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.002

（責任編輯 李莉）