基于基因組序列分析的煙草輕綠花葉病毒江蘇辣椒分離物侵染性克隆構建

高曉曉，涂麗琴，楊柳，劉亞楠，高丹娜，孫楓，李碩，章松柏，季英華

基于基因組序列分析的煙草輕綠花葉病毒江蘇辣椒分離物侵染性克隆構建

1江蘇省農業科學院植物保護研究所，南京 210014；2長江大學農學院/農林病蟲害預警與調控湖北省工程技術研究中心，湖北荊州 434025

【目的】煙草花葉病毒屬（）是危害辣椒、煙草等茄科作物的主要病毒之一，嚴重影響蔬菜作物的種植和生產。本研究旨在探明侵染江蘇省南京市辣椒的煙草輕綠花葉病毒（tobacco mild green mosaic virus，TMGMV）分離物（TMGMV-JS）的基因組結構特征、系統進化關系及其致病性，為TMGMV的防控提供科學依據。【方法】從江蘇省南京市采集的辣椒病樣，提取總RNA，利用TMGMV特異檢測引物確認陽性后，設計病毒特異性全長引物擴增TMGMV-JS全基因序列，通過同源重組的方法克隆至pCB301植物表達載體上，獲得TMGMV-JS分離物基因組序列和全長cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分離物與已報道分離物的同源性，利用MEGA7軟件的鄰接法進行系統進化分析。將侵染性克隆通過農桿菌浸潤本氏煙和辣椒，經RT-PCR和Western blot檢測驗證侵染效果，測定TMGMV-JS分離物的致病性。【結果】侵染江蘇省南京市辣椒的TMGMV全長序列為6 356 nt，編碼4個功能蛋白，分別為126K復制相關蛋白、183K復制酶、運動蛋白MP和外殼蛋白CP。同源性分析結果顯示TMGMV-JS與重慶分離物TMGMV-TN29（MF139550）同源性最高，廈門分離物（JX534224）次之，系統進化分析結果也顯示TMGMV-JS與其他TMGMV聚于同一大分支，其中與重慶、廈門兩個分離物在同一小分支，相對近緣。構建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆載體可以系統侵染本氏煙，引起葉片黃化，植株系統性壞死；也可以系統侵染辣椒，引起葉片斑駁、卷曲和植株矮化等癥狀。【結論】侵染江蘇省南京市辣椒的TMGMV-JS分離物基因組全長6 356 nt，與國內重慶、廈門TMGMV分離物具有較近的親緣關系，同屬于一個分支；構建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系統侵染本氏煙和辣椒，在本氏煙上會導致系統性壞死。

煙草輕綠花葉病毒；分子特征；侵染性克隆；致病性分析

0 引言

【研究意義】煙草輕綠花葉病毒（tobacco mild green mosaic virus，TMGMV）為煙草花葉病毒屬（）成員，主要危害煙草和辣椒（）等茄科作物[1]，還能侵染如夾竹桃科的狗牙花[2]、鳳仙花科的鳳仙花[3]、苦苣苔科[4]、鴨跖草科的小蚌蘭[5]等多種植物。TMGMV可通過機械摩擦傳毒，感染TMGMV后引起葉片褪綠、花葉、扭曲變形，且影響辣椒等茄科作物果實形狀和大小，降低其商品價值。辣椒是茄科辣椒屬一年或有限多年生草本植物，為重要的經濟作物和蔬菜作物，在生產過程中遭受多種病害侵擾，其中已報道約60多種病毒侵染辣椒[6]。江蘇省辣椒常年種植面積約8.00×104hm2以上[7]，近年來病毒病的發生隨著種植面積的擴大而加重。因此，分析侵染江蘇南京辣椒TMGMV的基因組特征和致病性，對該病毒病的防控具有重要意義。【前人研究進展】TMGMV是一種單鏈RNA病毒，基因組全長約6.4 kb，病毒包含4個開放閱讀框，分別編碼126K復制相關蛋白（126K replication-associated protein）和183K復制酶（183 kDa RNA-dependent RNA polymerase）、運動蛋白（movement protein，MP）和外殼蛋白（coat protein，CP）[8]。該病毒最早在煙草上發現，被認為是煙草花葉病毒（TMV-U2）的一種溫和形式[9]，后被命名為煙草輕綠花葉病毒[10]。目前在韓國[11]、委內瑞拉[12]、突尼斯[13]、巴拿馬[14]、密西西比[15]、美國[3]、土耳其[16]等多個國家和地區均有報道TMGMV的危害。國內最早在2005年臺灣地區的辣椒上檢測到TMGMV[17]，2013年在福建廈門辣椒上報道了該病毒[18]，之后在山東[19]、湖南[20]、重慶[21]和貴州[22]等地區出現危害。【本研究切入點】國內雖有多個省份報道TMGMV的危害，但TMGMV致病特征相關報道還很少，雖然國外有TMGMV致病相關報道，但其與國內分離物還存在一定差異，目前國內尚未見通過構建侵染性克隆研究TMGMV致病的相關報道。【擬解決的關鍵問題】以煙草輕綠花葉病毒江蘇辣椒分離物為對象，通過克隆其全基因組，明確其分子結構特征及分類地位，在此基礎上通過構建侵染性克隆解析該分離物的致病性，為辣椒上煙草輕綠花葉病毒病防控提供科學依據。

1 材料與方法

試驗于2021年1月至2022年9月在江蘇省農業科學院植物保護研究所完成。

1.1 樣本來源

供試樣品來自實驗室保存的感染TMGMV的辣椒病樣，樣品采自江蘇省南京市，采集后液氮冷凍置于-80℃冰箱保存備用。

1.2 RNA提取

參考吳淑華等[7]的方法，利用Trizol法提取RNA，Trizol試劑購自寶生物工程（大連）有限公司（Takara），提取的RNA樣品置于-80℃冰箱保存。

1.3 RT-PCR反應

以病樣總RNA為模板，利用Prime ScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Takara）進行反轉錄，反應體系：oligo dT Primer 1 μL，Randon 6 mers 1 μL，dNTP Mix 1 μL，ddH2O 5 μL，RNA 2 μL，于65℃ 5 min后，再加入5×Prime Script buffer 4 μL，RNase Inhibit 0.5 μL，Prime Script RNase 0.5 μL，ddH2O 5 μL，經30℃ 10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min，4℃結束，cDNA產物置于-20℃冰箱保存。根據TMGMV特異性檢測引物524-F和524-R（表1）進行PCR檢測驗證，PCR擴增總體系為20 μL：2×RapidMaster Mix（Takara）10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足。經95℃ 3 min；95℃ 15 s，47℃ 15 s，72℃ 20 s，35個循環；72℃ 5 min；12℃結束。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 本研究所用引物

1.4 TMGMV-JS全長序列克隆

根據已報道的TMGMV全長序列，設計病毒全長特異性引物TMGMV-ssF和TMGMV-ssR（表1），以cDNA產物為模板，PCR擴增總體系為50 μL：PrimeSTARTMMAX 25 μL，F和R端引物各2 μL，ddH2O 19 μL，cDNA 2 μL。經94℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 4 min，32個循環；72℃ 7 min，4℃結束后，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶大小。

1.5 TMGMV-JS侵染性克隆載體構建

利用Axygen割膠回收試劑盒回收PCR產物，回收產物通過同源重組技術連接到與經I和I雙酶切處理的植物表達載體pCB301上，利用載體通用引物pB-F和pB-R（表1）進行PCR檢測和酶切驗證后，將pCB301-TMGMV-JS重組質粒送至安徽通用生物公司進行序列測定。

1.6 序列分析

根據測序結果，利用DNAstar、Snap gene、Clustal W等軟件與NCBI上已公布的TMGMV全基因序列進行基因組結構特征及多重序列比對分析，并利用Blast網站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行同源性分析。利用MEGA7軟件的鄰接法（neighbor-joining algorithm）進行聚類分析以及系統進化樹的構建，進化樹的可信度使用1 000次自導復制驗證。

1.7 侵染性克隆在本氏煙和辣椒上的致病性分析

將pCB301-TMGMV-JS載體通過凍融法轉化GV3101農桿菌感受態細胞（擎科生物），同時轉化pCB301空載體作為對照，涂布于含有（50 mg·L-1）和（25 mg·L-1）抗生素的LB固體培養基，28℃倒置培養2—3 d。經PCR檢測后挑取單菌落培養至同樣抗性的LB液體培養基中，于28℃，220 r/min搖床過夜培養。當過夜培養物吸光度OD600 nm達到0.8—1.2時，6 000×室溫離心8 min富集菌體，配置浸潤液（10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES、100 μmol·L-1AS）重懸菌體，當懸浮液OD600 nm達到0.6時，28℃靜置培養2 h。選取3—4周齡本氏煙（），針頭輕戳中上部葉片背面，用1 ml注射器取懸浮液浸潤葉背，同時接種空載體pCB301作為對照。28℃，220 r/min過夜培養農桿菌菌液OD600 nm達0.8時，注射3—4周齡辣椒（豫櫻二號）莖稈。自接種日起記錄本氏煙和辣椒發病時間、癥狀以及發病率，生物試驗重復3次，每組3個重復。

采集200 mg發病樣品和對照組樣品，利用Trizol法提取植物總RNA，利用特異性檢測引物524-F和524-R進行RT-PCR檢測。取200 mg發病樣品和對照組樣品加入2倍體積RIPA裂解液（碧云天）提取總蛋白，于4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清加入適量5×SDS loading buffer混勻，99℃加熱10 min后12 000 r/min離心1min獲得蛋白樣品，取10 μL上清進行Western blot檢測。Western blot一抗為煙草花葉病毒屬通用抗體（實驗室保存），羊抗兔二抗購自碧云天。

2 結果

2.1 TMGMV-JS基因組全長序列克隆以及序列分析

選取TMGMV特異性檢測引物（524-F和524-R）RT-PCR檢測結果陽性的樣品作為模板，利用TMGMV-ssF和TMGMV-ssR特異性引物擴增病毒全長序列，通過同源重組的方法連接至pCB301載體后送至生物公司測序，獲得TMGMV-JS全基因序列，上傳至GenBank（登錄號：ON641839）。TMGMV-JS基因組全長6 356 nt，編碼4個功能蛋白，分別為126K復制相關蛋白（72—3 407 bp）、183K復制酶（72—4 901 bp）、運動相關蛋白MP（4 891—5 661 bp）和外殼蛋白CP（5 667—6 146 bp）。

BLAST分析結果顯示，TMGMV-JS核苷酸序列同源性與重慶TMGMV-TN29（MF139550）分離物最高，達99.83%，廈門分離物（JX534224）次之，同源性為99.76%。對TMGMV編碼蛋白的同源性進行分析發現CP蛋白氨基酸序列同源性與其他分離物相對較高，達98.74%—100%；183K蛋白氨基酸序列同源性相對較低，為97.76%—99.88%（表2）。這表明CP蛋白相較于其他蛋白在進化上比較保守。為研究TMGMV-JS與其他分離物的進化關系，使用Clustal W對TMGMV-JS與其他TMGMV代表性分離物及煙草花葉病毒屬其他成員的序列進行多重序列比對，利用MEGA7軟件鄰接法進行1 000次自導復制驗證構建系統發育樹，結果顯示TMGMV-JS與已報道的TMGMV其他分離物歸入同一個大分支，而與煙草花葉病毒屬其他成員如番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）、番茄斑駁花葉病毒（tomato mottle mosaic virus，ToMMV）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、辣椒斑駁花葉病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）、油菜花葉病毒（youcai mosaic virus，YoMV）歸入不同分支；在TMGMV大分支中TMGMV-JS與重慶TMGMV-TN29分離物（MF139550）、廈門分離物（JX534224）共同聚于一個小分支，暗示其與這兩個分離物親緣關系較近（圖1）。

表2 TMGMV-JS與9個分離物及其他5個煙草花葉病屬病毒的核苷酸和氨基酸序列同源性

從NCBI中下載TMGMV不同分離物和其他煙草花葉病毒屬病毒經典菌株的全基因組序列，用MEGA7軟件采用鄰接法構建系統發育樹The genomes of TMGMV isolates and other classic strains of tobamoviruses were downloaded from NCBI. MEGA7 software was used to construct phylogenetic tree by neighbor-joining method. =: TMGMV Jiangsu isolate sequenced in this study

2.2 TMGMV侵染性克隆載體的構建

利用TMGMV基因全長引物TMGMV-ssF和TMGMV-ssR擴增獲得約6 300 bp的目的條帶，利用酶切位點I和I連接至pCB301載體上，經PCR檢測和酶切驗證獲得農桿菌侵染性克隆載體pCB301-TMGMV-JS（簡稱為pTMGMV-JS）（圖2）。

2×35S：CaMV 35S啟動子CaMV 35S promoter；126K：126K復制相關蛋白126K replication-associated protein；183K：183K復制酶 183K replicase；MP：運動蛋白movement protein；CP：外殼蛋白coat protein；HDRz：核糖剪切酶hepatitis delta virus ribozyme；NOS：NOS 終止子NOS terminator；LB：左臂left border；RB：右臂right border

2.3 侵染性克隆載體在本氏煙上的致病性

為研究TMGMV-JS侵染性克隆是否構建成功以及在本氏煙上的致病特征，將pTMGMV-JS侵染性克隆通過農桿菌浸潤法接種本氏煙，結果顯示浸潤后第5天，處理組本氏煙新葉出現斑駁，同時上部葉片伴隨下卷、黃化等癥狀，第8天時，植株上部葉片出現萎蔫、壞死癥狀，植株表現系統性死亡，而對照組生長正常（圖3-A）。

采集發病葉片，RT-PCR檢測結果顯示接種pTMGMV-JS的煙草可以檢測到TMGMV特異條帶，對照組未檢測到目的條帶（圖3-B）。Western blot檢測結果也顯示接種pTMGMV-JS的本氏煙可檢測到約18 kDa的CP蛋白，對照組未檢測到目的蛋白（圖3-C）。上述結果說明pTMGMV-JS侵染性克隆構建成功，同時也表明TMGMV-JS可以系統性侵染本氏煙，導致系統性壞死，表現出較強的致病性。

A：pTMGMV-JS侵染性克隆接種本氏煙第8天癥狀圖，pCB301為對照組Symptoms of N. benthamiana inoculated by pTMGMV-JS infectious clone at 8 dpi, pCB301 was the negative control group；B：RT-PCR檢測結果（8 dpi） RT-PCR detection at 8 dpi. M: DL5000 DNA marker；C：Western blot檢測結果（8 dpi）Western blot detection at 8 dpi. M: Protein marker

2.4 侵染性克隆載體在辣椒上的致病性

為研究TMGMV-JS在辣椒上的致病性，將pTMGMV-JS侵染性克隆通過農桿菌注射辣椒莖稈，結果發現接種14 d后辣椒上部葉片出現黃化、下卷等癥狀，有些病株伴有葉基部出現褐色壞死斑，植株矮小等癥狀（圖4-A、4-B），接種30 d后，辣椒出現葉片斑駁，下卷等癥狀，植株伴有輕微矮化（圖4-C）。采集發病葉片，經RT-PCR和Western blot檢測結果顯示，接種pTMGMV-JS的辣椒樣品可以檢測到目的條帶，對照組未檢測到目的條帶（圖4-D、4-E）。上述結果表明構建的pTMGMV-JS侵染性克隆成功，同時也說明TMGMV-JS可以系統侵染辣椒，并引起葉片斑駁、下卷等癥狀。

3 討論

3.1 TMGMV江蘇辣椒分離物基因組序列分析

本研究通過整段擴增法獲得了侵染江蘇南京辣椒的TMGMV全基因組，明確了TMGMV-JS分離物全長6 356 nt，編碼4個功能蛋白：126K、183K、MP和CP。TMGMV-JS分離物與中國重慶分離物的同源性最高，廈門分離物次之，而與美國、斯洛文尼亞、意大利、巴西、日本等國外分離物的同源性較低，相對遠緣，同時分析結果也顯示TMGMV-JS與中國長沙分離物（98.36%）、中國臺灣分離物（97.11%）之間的同源性也相對較低，暗示了我國TMGMV可能存在較多的變異類群，因此針對區域TMGMV的群體展開調查，明確優勢病毒群體，對于病毒的有效防控具有重要指導意義。

3.2 TMGMV江蘇辣椒分離物侵染性克隆載體的構建

構建侵染性克隆是研究植物病毒的致病特征、病毒與寄主互作方式的重要手段，目前常用的手段有兩種，一種是將病毒基因組構建到T7等原核啟動子下，通過體外轉錄進行侵染；另一種是將病毒基因組構建到35S等啟動子下，通過農桿菌介導的方式進行侵染。本研究利用含有2×35S啟動子的pCB301載體，構建了TMGMV-JS的侵染性克隆，并通過農桿菌浸潤法接種本氏煙和辣椒，研究TMGMV-JS的致病性，發現TMGMV-JS導致本氏煙系統性壞死；而辣椒出現明顯的斑駁，葉片下卷等癥狀，同時在實驗室內還觀察到發病辣椒伴有明顯的葉片早脫落現象。目前國外也有TMGMV侵染性克隆相關報道，但多是通過T7啟動體外轉錄的方式實現[23-25]，如Morishima等[26]將TMGMV-J日本分離物構建到T7啟動子下，通過體外轉錄的方式對其致病性進行研究，發現TMGMV-J可以系統侵染辣椒和煙草，導致普通煙局部壞死癥狀。本研究發現TMGMV-JS也可以系統侵染辣椒和煙草，且在本氏煙上會導致壞死癥狀，但相較于體外轉錄的方式，農桿菌介導的接種方式無需體外RNA轉錄，操作更方便，也更經濟，為后續深入解析TMGMV的致病機理提供了便利。

3.3 TMGMV致病性分析

TMGMV是煙草花葉病毒屬的重要成員，已有多地報道其侵染危害辣椒、煙草等作物。Font等[13]報道TMGMV摩擦接種辣椒后會引起葉片輕微褪綠等癥狀；Li等[17]在研究我國臺灣分離物（TMGMV-HP）時，發現TMGMV可以侵染多種煙草，其中在本氏煙上會表現系統性褪綠癥狀，在辣椒上起初葉片表現輕微褪綠，而后出現壞死、葉片脫落癥狀。而本研究在分析TMGMV-JS致病性時發現其在本氏煙上會引起系統性壞死，而在辣椒上未觀察到壞死癥狀。這些結果暗示了不同分離物在致病性上可能存在差異，而TMGMV-JS與TMGMV-HP基因組核苷酸序列的同源性僅97.11%，這種基因組上的差異可能是導致接種癥狀出現差異的重要原因之一，因此針對本地病毒分離物群體進行研究對于解決區域問題具有重要意義。

A、B：pTMGMV-JS侵染性克隆接種辣椒第14天癥狀圖，pCB301為對照組Symptoms of C. annuum inoculated by pTMGMV-JS infectious clone at 14 dpi, pCB301 was the negative control group；C：pTMGMV-JS侵染性克隆接種辣椒第30天癥狀圖 Symptom of C. annuum inoculated with pTMGMV-JS infectious clone at 30 dpi；D：RT-PCR檢測結果（14 dpi）RT-PCR detection at 14 dpi。M: DL5000 DNA marker；E：Western blot檢測結果（30 dpi）Western blot detection at 30 dpi。M: Protein marker

TMGMV在不同寄主作物上導致不同的癥狀，暗示TMGMV對不同作物造成的威脅存在差異，利用構建的侵染性克隆可以快捷地評估病毒對作物的危害，研究病害的發生規律，有針對性地篩選抗性品種或者實施阻斷措施，為病害的有效防控提供支撐。辣椒在我國多省份均有種植，目前報道的可以侵染辣椒的病毒種類繁多，且常出現復合侵染，其中煙草花葉病毒屬就有多種病毒[27]。煙草花葉病毒屬的病毒可以通過摩擦傳播，在田間農事操作過程中極易傳播擴散，同時也可以通過種子傳播，隨著種苗調運等途徑遠距離擴散危害。TMGMV屬于煙草花葉病毒屬，本研究的結果顯示其可以單獨侵染辣椒并危害，雖然目前尚不清楚TMGMV與其他病毒復合侵染是否會造成更大的危害，但鑒于其具有機械傳播和種傳特征，擴散流行威脅極大，生產上應密切關注，加強種苗監測，早發現，早防控，減少TMGMV對產業健康發展造成的危害。

4 結論

煙草輕綠花葉病毒江蘇辣椒分離物（TMGMV- JS）基因組大小6 356 nt，與重慶TMGMV-TN29分離物同源性最高，廈門分離物次之。成功構建TMGMV- JS的侵染性克隆并測定了其致病性，發現TMGMV-JS可系統侵染本氏煙，導致系統性壞死；而在辣椒上TMGMV-JS侵染導致辣椒出現葉片斑駁、下卷等癥狀。

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Construction of an infectious clone of Tobacco mild green mosaic virus isolate infecting pepper from Jiangsu based on genomic clone

1Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014;2College of Agriculture, Yangtze University/Hubei Engineering Research Center for Pest Forewarning and Management, Jingzhou 434025, Hubei

【Objective】is one of the main viruses that infect Solanaceae crops such as pepper and tobacco, which seriously affects the cultivation and production of crops. The purpose of this study is to investigate the genomic structural characteristics, phylogenetic relationship and pathogenicity of tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) isolate infected pepper in Nanjing City of Jiangsu Province (TMGMV-JS), and to provide a scientific basis for the prevention and control of TMGMV. 【Method】Total RNA was extracted from disease pepper samples, then the positive samples were confirmed by specific detection primers of TMGMV. Subsequently, a pair of primers were designed and used to amplify the full-length genome sequence of TMGMV-JS isolate. The infectious cDNA clone of TMGMV-JS isolate was obtained by cloning the amplified products into pCB301 vector by homologous recombination. Then the homology of TMGMV-JS isolate with reported isolates was analyzed by BLAST and the neighbor-joining method of MEGA7 software was used for the phylogenetic analysis.andwere infiltrated with the infectious cDNA clone mediated by. Furthermore, RT-PCR and Western blot were determined to define the pathogenicity of TMGMV-JS isolate.【Result】TMGMV-JS isolate contains 6 356 nt, encoding four functional proteins, 126K replication-associated protein, 183K replicase, movement protein MP, and coat protein CP. Homology analysis showed that TMGMV-JS isolate shared the highest identity with Chongqing TMGMV-TN29 isolate (MF139550), followed by Xiamen isolate (JX534224). Phylogenetic analysis showed that TMGMV-JS was clustered in a big branch with other TMGMV isolates and relatively closed to Chongqing and Xiamen isolates in a small branch. Furthermore, the constructed pCB301-TMGMV-JS infectious cDNA clone can systematically infect, causing leaf yellow and systemic necrosis symptoms. It can also systematically infect, causing symptoms such as leaf mottle, curling and dwarfing symptoms. 【Conclusion】The full-length genome of TMGMV-JS isolate infectingfrom Nanjing City, Jiangsu Province is 6 356 nt, which is closely related to Chongqing and Xiamen isolates and belongs to the same branch. Significantly, the constructed infectious clone of TMGMV-JS can systemically infectand, causing systemic necrosis symptoms on.

tobacco mild green mosaic virus (TMGMV); molecular characteristic; infectious clone; pathogenicity analysis

2023-01-16；

2023-02-07

國家重點研發計劃（2022YFD1401202）、國家自然科學基金（32072506）、江蘇省農業科技自主創新基金項目（CX(21)1011）、國家現代農業產業技術體系（CARS-24-C-01）、沿海集團揭榜掛帥（2022YHTDJB03）、高端外國專家引進計劃（G2022014073L）

高曉曉，E-mail：2424054181@qq.com。通信作者季英華，E-mail：jiyinghua@jaas.ac.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.006

（責任編輯 岳梅）