兒童傳染性單核細胞增多癥EB病毒載量及外周血T淋巴細胞亞群分布與肝損傷的相關性

王志銀,王世巖,劉京碩,宋琛,張海光

(新鄉醫學院第一附屬醫院 a.檢驗科;b.婦產科,河南 衛輝 453100)

傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleosis,IM)是由EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染后引發的常見血液系統疾病類型,兒童和青少年由于免疫系統發育不完全是EBV感染的高危人群[1-2]。EBV感染B淋巴細胞后可在一定條件下激活并釋放EBV病毒顆粒,進而激發機體免疫應答,人體免疫系統在殺傷病毒的同時對機體造成免疫破壞,是IM發病的主要原因和機制[3-4]。IM的癥狀多表現為發熱、淋巴結炎癥等,多數預后良好,但也有少數患兒會合并急性或慢性并發癥,如肝損傷、腎損傷、嚴重扁桃體增大伴氣道阻塞等,其中肝損傷是較為常見的類型。相關研究提示,EBV感染后免疫破壞的程度可能與并發肝損傷及預后具有一定相關性,但尚未有明確結論[5]。基于此,本研究擬通過檢測IM患兒外周血T淋巴細胞亞群及肝臟損傷標志物水平,分析IM患兒EBV感染后的病毒載量及免疫狀態與肝臟損傷程度的相關性,從而為臨床預后評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象40例IM患兒來自2021年1月至2022年12月在新鄉醫學院第一附屬醫院兒科就診的患兒(IM組),其中男25例,女15例;年齡11～131個月,平均(56.4±30.3)個月。入組標準[6]:(1)有發熱、咽峽炎、頸部淋巴結或肝脾大等典型的臨床特征;(2)抗EBV衣殼抗原IgM和IgG抗體陽性等;(3)外周血淋巴細胞絕對值>5.0×109L-1和異型淋巴細胞比率≥10%;(4)首次確診,且年齡≤14歲;(5)未接受系統性治療。排除標準:(1)有除EBV以外的其他微生物感染證據;(2)合并EBV感染相關的嗜血細胞綜合征、淋巴瘤等血液系統疾病及重大的免疫缺陷性疾病;(3)長期服用糖皮質激素或免疫抑制劑等藥物;(4)有既往EBV感染史。另隨機選擇同期來院體檢的40例健康兒童為對照組,其中男25例,女15例,年齡19～132個月,平均(62.5±29.8)個月。兩組兒童在性別及年齡上比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經受試者監護人同意及新鄉醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 標本采集采集每位IM患兒及健康兒晨起空腹外周靜脈血10 mL,其中乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝3管,每管2 mL,分別用于血常規、T淋巴細胞亞群及EBV核酸定量檢測;普通促凝管4 mL,用于肝功能指標谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)及谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的檢測。

1.3 主要試劑和儀器流式細胞儀(DxFlex型)、流式熒光單抗試劑CD4-FITC、CD8-PE、CD3-ECD、CD45-PC7、單克隆同型對照IgG1-FITC/PE/ECD/PC7、自動生化分析儀(AU-5800型)、ALT、AST檢測試劑盒均為美國貝克曼庫爾特有限公司生產;EBV核酸檢測試劑盒及Smart全自動核酸提取儀(廣州達安基因股份有限公司);Mx3000熒光定量PCR儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司); XN-2000型全自動血細胞分析儀及血常規檢測相關試劑(希森美康醫用電子有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群 取流式專用試管2支,分別標記為A管、B管,A管中加入CD45-PC7、CD4-FITC、CD8-PE、CD3-ECD各20 μL,然后加入充分混勻后的抗凝全血100 μL,震蕩混勻,室溫孵育15 min,加入溶血素500 μL,震蕩混勻,孵育10 min,加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS),200g離心5 min,棄上清,加入500 μL PBS重懸;B管使用單克隆同型對照抗體重復上述步驟,樣本制備完成后,流式細胞儀上機檢測。

1.4.2測定EBV核酸定量 血液樣品處理后提取DNA,使用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)-熒光探針法進行EBV DNA定量分析,操作按照試劑盒說明書進行:將提取出的DNA加入到預混的反應體系中,再進行擴增。擴增條件為:93 ℃ 2 min,93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,共10個循環;93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,共30個循環;而后25 ℃ 10 s冷卻。反應結束后,依據標準曲線儀器自動讀取EBV拷貝數并顯示結果。

1.4.3白細胞及肝功能指標檢測 采用全自動血細胞分析儀檢測兩組兒童的白細胞計數并分類:白細胞計數(white blood cells count,WBC)、中性粒細胞百分比(Net%)、淋巴細胞百分比(LYM%)及單核細胞百分比(Mon%),采用全自動生化分析儀檢測肝功能指標ALT及AST。

2 結果

2.1 IM組與對照組兒童白細胞分類計數比較IM組患兒WBC、LYM%高于對照組,Net%低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05);兩組間Mon%差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 IM組與對照組白細胞分類計數比較

2.2 IM組與對照組兒童T淋巴細胞亞群的比較IM組患兒外周血CD3+、CD3+CD8+T淋巴細胞比率均高于對照組,CD3+CD4+T淋巴細胞比率及CD4+/CD8+的比值均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 IM組與對照組T淋巴細胞亞群分布比較

2.3 IM組與對照組兒童肝損傷標志物比較IM組患兒的肝功能標志物ALT、AST水平均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 IM組與對照組肝損傷標志物比較

2.4 IM組患兒病毒載量與肝臟損傷標志物的相關性IM組患兒EBV DNA載量水平為(70.95±1.03)×103copies·mL-1,對照組兒童EBV DNA載量水平低于最低檢測值(0.5×103copies·mL-1)。Pearson相關性分析結果顯示,IM組患兒的EBV DNA載量水平與ALT和AST水平均呈正相關(P<0.05)。

2.5 IM患兒T淋巴細胞亞群與肝損傷標志物的相關性Pearson相關性分析結果顯示,CD3+T細胞比率與ALT及AST水平均呈正相關(P<0.05),CD3+CD4+T細胞比率與AST呈正相關(P<0.05)。CD3+CD4+T細胞比率與ALT、CD3+CD8+T細胞比率及CD4+/CD8+比值與ALT、AST間均未發現相關性(P>0.05)。

3 討論

兒童及青少年由于免疫系統發育不完善,免疫功能較弱,易受EBV感染并引起IM的發病[7-8]。雖然IM屬于自限性疾病,大部分患兒預后較好,但是由于免疫力個體差異的原因,部分患兒可出現腦膜炎、周圍神經病變、肝功能損傷等并發癥,對患兒造成一定損傷及后遺癥[9-10]。因此,密切監測患兒病情進展并及時預防相關并發癥的發生對于改善患兒預后、提高生存質量具有重要意義。ALT及AST是用于評估肝損傷的最主要標志物。EB病毒雖然為非嗜肝病毒類型,但其引起的急慢性感染依然為肝功能帶來了許多不良影響[11]。本研究結果顯示,與健康兒相比,IM組患兒肝功能指標ALT及AST存在一定程度的升高,提示IM患兒發生肝損傷的機率較大。通過病毒DNA載量與ALT及AST相關性的分析發現,病毒載量越高,ALT及AST水平也相對升高,提示以病毒載量為指征的病情嚴重程度與引起的免疫性肝臟損傷的風險呈正相關性。因此,提示臨床在檢驗結果顯示病毒載量過高時應適當給予預防性肝損傷治療。

已有研究顯示,IM患兒EB病毒感染后的免疫狀態與預后及轉歸具有密切相關性[12-13]。T淋巴細胞亞群分布特征是機體免疫狀態的重要體現,其中CD4+T細胞主要輔助B細胞產生中和抗體,當患兒EBV病毒激活后B細胞的功能受到一定影響,此時機體的免疫功能受到抑制,導致CD4+輔助性T細胞的比率降低[14]。CD8+T細胞是殺傷病毒感染B細胞的主要細胞,當EBV病毒開始復制時,免疫系統會提高CD8+T細胞比率用于抑制病毒復制[15]。因此,CD4+及CD8+細胞比率是反映機體免疫狀態的指征之一,而CD4+/CD8+比值是判斷人體免疫功能平衡或紊亂的敏感指標[16-17]。本研究結果顯示,IM患兒外周血WBC、LYM%均高于對照組,Net%低于對照組,CD3+、CD3+CD8+T淋巴細胞水平高于對照組,CD4+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值低于對照組,提示IM患兒的細胞免疫功能處于抑制狀態,與EBV感染后對免疫系統的攻擊有關。有研究顯示,EB感染后患兒除發熱、頭痛等,部分還合并表現出嚴重的疲勞、惡心、嘔吐和納差,體現其可能并發肝損傷或輕度肝炎[18]。有研究甚至發現在超過90%的EBV感染相關IM病例中合并肝臟受累[19],但通常是短暫性、輕度和自限性的,或僅通過支持治療即可控制,極少數病例合并由感染引起的嚴重或致命性肝炎,但多在免疫功能低下的病例中出現,提示其發病與免疫反應的相關性[20-21]。本研究結果顯示,IM患兒的CD3+T細胞比率與肝功能指標ALT及AST、CD3+CD4+T細胞比率與AST均呈正相關,提示IM患兒很可能由于CD3+T淋巴細胞的過度激活造成肝損傷,并由于機體的整體免疫失衡狀態加劇肝損傷狀態。臨床診療過程中應對該方面進行密切關注,以避免IM患兒預后不良。

綜上所述,IM患兒的病毒載量及外周血T淋巴細胞亞群分布特征可作為表征或預測肝損傷的指征,對于臨床檢測結果為高病毒載量、高CD3+T淋巴細胞水平的患兒應密切監測肝功能,并及時采取干預措施以降低患兒肝損傷的概率。本研究局限性在于收集病例周期短、樣本量較小,僅在肝功能損傷指征方面提出初步研究思路,在進一步研究中,會繼續加大樣本量、延長觀察周期,以獲取更準確的結論。