胃腸胰神經內分泌腫瘤中GSK-3β、LDHA表達及其與臨床病理特征的關系

閆隔,趙娜,張營

(1.鄭州市第十五人民醫院 病理科,河南 鄭州 450041;2.鄭州市中心醫院 病理科,河南 鄭州 450000;3.河南電力醫院 病理科,河南 鄭州 450000)

神經內分泌腫瘤系起源于神經內分泌細胞腫瘤,可發生于身體任何部位,但最常見的是胃腸胰腺神經內分泌腫瘤(gastrointestinal pancreatic neuroendocrine tumors,GEP-NENs)約占全部神經內分泌腫瘤2/3[1]。因GEP-NENs異質性較強,臨床中大多數生物標志物的靈敏度、特異度及可重復性較差。因此,需尋找新型生物標志物以期在GEP-NENs疾病診斷、治療及預后評估中起到關鍵作用[2]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)為一種保守絲氨酸/蘇氨酸激酶,可調節多種蛋白因子及參與多種信號通路傳導,調控細胞分化、增殖與凋亡[3]。乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)為一種糖酵解關鍵酶,既能催化丙酸和L-乳酸的氧化還原反應,也能催化相關α-酮酸[4]。研究發現,GSK-3β、LDHA在多種惡性腫瘤中存在異常表達情況,但關于二者在GEP-NENs中的表達及其與臨床病理特征關系報道較少。本研究回顧性分析了GSK-3β、LDHA在GEP-NENs中的表達及其與臨床病理特征的關系,旨在為GEP-NENs臨床防治提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2021年6月至2022年6月收治的98例GEP-NENs患者。(1)納入標準:①符合《中國胃腸胰神經內分泌腫瘤病理診斷共識(2020版)》[5]診斷標準,且經影像學檢查確診;②術前未接受任何治療;③臨床資料完整。(2)排除標準:①合并心、肝、腎嚴重功能障礙;②合并除GEP-NENs外其他惡性腫瘤;③合并自身免疫病;④合并感染性疾病;⑤臨床資料不完整。

1.2 方法

1.2.1收集資料 收集所有患者性別、年齡、手術方式、腫瘤最大徑、腫瘤部位、TNM分期、病理分級、浸潤程度、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況以及神經內分泌標志物突觸素(synaptophysin,Syn)、嗜鉻素A(chromogranin A,CgA)表達情況。

1.2.2標本來源 術后留存新鮮(離體30 min內)癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5 cm)標本,置入EP管,液氮冷凍并于-80 ℃下冷藏待檢。

1.2.3主要試劑 兔抗人GSK-3β多克隆抗體、兔抗人LDHA多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司),免疫組化SP-9000試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10%山羊血清封閉液、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2.4檢測方法 采用免疫組化SP法檢測GEP-NENs癌組織及癌旁正常組織中的GSK-3β、LDHA表達情況,具體步驟如下。

1.2.4.1GSK-3β (1)取組織石蠟包塊,常規切片(4 μm)、脫蠟處理;(2)高壓修復抗原;(3)阻斷滅活內源性過氧化物酶;(4)滴加羊血清封閉;(5)滴加采用PBS稀釋至1∶200兔抗人GSK-3β一抗,PBS沖洗;(6)滴加經辣根過氧化物酶標記的二抗;(7)滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶;(8)DAB顯色;(9)蘇木精復染;(10)脫水、透明、封固、鏡檢。設置PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.4.2LDHA (1)取組織石蠟包塊,常規切片(4 μm)、脫蠟處理;(2)高壓修復抗原;(3)阻斷滅活內源性過氧化物酶;(4)滴加羊血清封閉;(5)滴加采用PBS稀釋至1∶300兔抗人LDHA一抗,PBS沖洗;(6)滴加經辣根過氧化物酶標記的二抗;(7)滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶;(8)DAB顯色;(9)蘇木精復染;(10)脫水、透明、封固、鏡檢。設置PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.5結果判讀 由2位經驗豐富病理醫生雙盲法單獨閱片,并隨機選擇高倍光學顯微鏡下(200×)的5處視野,每處視野選取100個細胞,以陽性細胞占比與染色強度之和判定GSK-3β表達情況,以陽性細胞占比與染色強度乘積判定LDHA表達情況,具體標準見表1。

1.3 統計學方法數據采用SPSS 22.0軟件處理。計數資料采用頻數和百分數(%)表示,組間差異行χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

表1 GSK-3β、LDHA表達判定標準

2 結果

2.1 GSK-3β、LDHA在GEP-NENs組織中的表達免疫組化結果顯示,98例癌組織中GSK-3β高表達高于癌旁正常組織,差異有統計學意義(P<0.05);98例癌組織中LDHA高表達高于癌旁正常組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 GSK-3β、LDHA在GEP-NENs組織中的表達[n(%)]

2.2 GSK-3β、LDHA表達與GEP-NENs患者臨床病理特征的關系GSK-3β、LDHA表達均與GEP-NENs患者的TNM分期、病理分級、浸潤程度、淋巴結轉移情況有關(P<0.05),而與GEP-NENs患者的性別、年齡、手術方式、腫瘤最大徑、腫瘤部位、遠處轉移及Syn、CgA表達情況無關(P>0.05)。見表3、4。

表3 GSK-3β表達與GEP-NENs患者臨床病理 特征的關系[n(%)]

表4 LDHA表達與GEP-NENs患者臨床病理特征的 關系[n(%)]

3 討論

國外研究顯示,GEP-NENs發病率正逐漸增高[6],但我國目前尚缺乏發病率數據。目前,尚不清楚GEP-NENs確切病因,且多數患者臨床表現無特異性,未能引起足夠重視,因而多數患者確診時疾病已進展至中晚期,預后較差。因此,早期診斷并積極治療意義重大[7-8]。目前用于GEP-NENs診斷的生物標志物多為疾病癥狀及神經內分泌細胞分泌產物,如胰高血糖素、促胃液素、胰島素、5-羥吲哚乙酸等,但此類標志物多局限于特定神經內分泌腫瘤[9]。為尋找適用范圍更廣、診斷價值更高生物標志物,本研究分析了GSK-3β、LDHA在GEP-NENs中表達及與臨床病理特征關系。

GSK-3β為一種具有多功能的胞漿蛋白,主要在細胞核及線粒體中表達,且活性較高。研究表明,GSK-3β參與了多種惡性腫瘤細胞增殖、生長、侵襲、轉移及凋亡過程,為關鍵的腫瘤治療靶點;此外,研究還發現GSK-3β在不同類型惡性腫瘤中具有促癌及抑癌2種相反作用[10-11]。本研究結果表明,GSK-3β在GEP-NENs癌組織中呈高表達,與胡媛等[12]研究結果一致,提示GSK-3β表達上調可能在GEP-NENs發生、發展中扮演關鍵角色。進一步分析GSK-3β表達與患者臨床病理特征發現,TNM分期、病理分級更高、浸潤程度更深以及發生淋巴結轉移的GEP-NENs組織中GSK-3β表達水平更高,說明GSK-3β參與了GEP-NENs發生、發展、侵襲、轉移過程。分析原因可能為:(1)GSK-3β以去磷酸化效用參與GEP-NENs細胞增殖及分化;(2)GSK-3β正性調節核轉錄因子-kB(NF-kB),激活B淋巴細胞瘤-2基因(BCL-2)、X連鎖凋亡抑制蛋白基因(XIAP)、細胞周期蛋白D1基因(cyclin D1)等多種靶基因表達,從而促進GEP-NENs細胞增殖、轉移;(3)抑制GSK-3β表達可干擾Rac1亞細胞的定位,抑制基質降解、驅使細胞遷移以及侵襲性板狀偽足生成,從而抑制GEP-NENs細胞侵襲、轉移。

腫瘤細胞一系列生物學行為都需要能量代謝支持。腫瘤細胞處于有氧環境中亦更多地以無氧糖酵解方式獲得能量,此效應被稱為有氧糖酵解效應(Warburg效應)[13]。LDHA為Warburg效應中關鍵酶,被證實與多種惡性腫瘤的發生、發展息息相關,同時也被認為是一個極具希望的腫瘤治療靶點[14]。本研究結果表明,LDHA在GEP-NENs癌組織中呈高表達,和鞏芮寧等[15]報道結果相同,提示LDHA表達上調可能在GEP-NENs發生、發展中扮演關鍵角色。進一步分析LDHA表達與患者臨床病理特征發現,TNM分期、病理分級更高、浸潤程度更深以及發生淋巴結轉移的GEP-NENs組織中LDHA表達水平更高,說明LDHA參與了GEP-NENs發生、發展、侵襲、轉移過程。分析原因可能為:(1)LDHA可促進乳酸生成來改變腫瘤細胞內部微環境,并抑制機體免疫監測,從而促進GEP-NENs發生、發展;(2)抑制LDHA表達可促進活性氧生成,使得肌動蛋白重構功能減弱,抑制腫瘤細胞侵襲、轉移;(3)LDHA通過調節上皮間質轉化過程促進GEP-NENs細胞轉移。

綜上所述,GSK-3β、LDHA在GEP-NENs中均呈過表達,且其表達水平與GEP-NENs患者TNM分期、病理分級、浸潤程度、淋巴結轉移情況密切相關。本研究不足之處在于本研究為回顧性研究,選取樣本量較少,可能對研究結果產生一定偏倚。此外,本研究僅分析了GSK-3β、LDHA表達與GEP-NENs臨床病理特征的關系,未分析與GEP-NENs患者預后的關系。以上不足有待進一步研究完善。