推拿對CCI模型大鼠海馬CaMKⅡ和SYP蛋白表達的影響*

黃紅葉，林志剛，陳水金，陳樂春，張幻真，陳進城，蔣晶晶，江 煜，王曉華，方佳鈺

（1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003；3.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350003）

神經病理性疼痛是一種復雜的慢性疼痛，由中樞或周圍神經系統的損傷或功能障礙引起[1]。行為學上，它的特征是異常的自發性疼痛，疼痛知覺的改變，以及刺激誘發的異常疼痛癥狀，已造成巨大的社會和經濟負擔[2]。臨床與動物研究均發現推拿可顯著緩解神經病理性疼痛，但鎮痛機制尚不明確[3-4]。

鈣調蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependent protein kinase II,CaMKⅡ）是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸化蛋白激酶，參與疼痛中樞敏化，對神經元可塑性有重要意義[5]。突觸素（synaptophysin，SYP）表達于突觸囊泡膜，參與了突觸的形成與調節，在神經病理性疼痛發生發展中起重要作用[6]。CaMKⅡ和SYP 是突觸相關蛋白，其在神經病理性疼痛大鼠脊髓背角中的表達增加[7-8]，在海馬中降低[9-10]，提示神經病理性疼痛的發生可能與脊髓背角和海馬的突觸可塑性的改變有關。我們前期研究發現推拿能夠抑制脊髓背角突觸可塑性[11],基于此，本研究通過觀察推拿手法對CCI大鼠海馬神經元及突觸相關蛋白CaMKⅡ與SYP 的表達，探討推拿手法的鎮痛機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 取32 只體質量180-200g，成年雄性SD 大鼠，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。正式實驗前適應性喂養1周后，隨機分為空白組、假手術組、模型組、推拿組，每組8只。

1.2 實驗試劑與器材 大鼠固定器（專利號：201821139321.X）、自制推拿按摩指套（專利號：ZL201821318407.9）、HE 染色試劑盒（索萊寶）、兔多克隆抗體CAMKⅡ（proteintech）、兔多克隆抗體Syn‐aptophysin（proteintech）、GAPDH 內參（proteintech）、488 綠色熒光二抗（proteintech）、HRP 標記抗兔二抗（proteintech）、BCA 蛋白定量試劑盒（博士德）、SDSPAGE 凝膠制備試劑盒（博士德）、蛋白質常規分子量標（proteintech）、ECL 超敏化學發光檢測試劑盒（百賽生物）、抗熒光淬滅封片液（碧云天）、ImageLab 圖像分析系統，ImageJ圖像處理軟件。

1.3 造模方法 根據Bennett和Xie[12]方法制備坐骨神經慢性壓迫性損傷(Chronic Constriction Injury，CCI) 大鼠模型。用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，i.p.）麻醉大鼠后，暴露大鼠右大腿坐骨神經，使用4-0 鉻制羊腸線結扎坐骨神經，結扎4 道，每道間隔1.0-1.5mm，以觀察到大鼠后肢肌肉輕微抽動為宜。空白組不做任何處理，假手術組大鼠僅暴露右坐骨神經，不結扎。

1.4 推拿干預 手法操作前先將大鼠置于推拿操作固定裝置5min，適應環境。操作時，用右手拇指對大鼠右后肢委中穴進行推拿按揉法操作。手法選擇：按揉法為臨床常用治療手法，對于疼痛有明顯緩解作用。依據前期預實驗經驗，自制推拿按摩指套（專利號：ZL201821318407.9）最佳手法頻率為30 次/分鐘，力量約4-6N，持續10 分鐘。穴位選擇：由于“委中穴”所在位置為大鼠股二頭肌，此處肌肉較為豐滿，便于進行按揉手法操作；此外，由大鼠腰膨大發出的脊神經根穿出椎間孔后向下組成坐骨神經，支配股二頭肌，因此我們選取右后肢“委中穴”進行推拿按揉治療，可使推拿起到較好治療作用。推拿治療從術后第4天開始，每日1次，連續14天。

1.5 觀察指標

1.5.1 機械足反射閾值（PWT）參照Chaplan[13]的研究，每只大鼠被放入有鋼絲網底部的有機玻璃盒子中，以適應周圍環境30 分鐘。使用不同等級的Von-Frey 纖毛刺激大鼠右后爪足底表面，由低等級逐級向高等級測試，引起大鼠出現縮足、舔腳等反應時的刺激強度定義為機械足反射閾值（PWT）。分別在術前1 天、術后第4、10、14 和18 天觀察各組大鼠PWT改變。

1.5.2 HE 染色 推拿干預14 天后，每組取4 只大鼠，麻醉后灌流固定，取出大鼠全腦，置于4%多聚甲醛中固定48h，經脫水、包埋、切片和置片程序備好石蠟切片。取海馬區域的石蠟切片，經梯度酒精脫水，蘇木素染色5min，流水沖洗3min，鹽酸酒精分化2s，伊紅染色30s，流水沖洗5min 后中性樹脂封片。400 倍鏡下觀察左側海馬神經元形態，染色結果為細胞核藍色，細胞質紅色。

1.5.3 免疫熒光染色 海馬石蠟切片梯度酒精脫水，放入煮沸的EDTA 修復液中高溫修復2h。經PBS 洗滌，加入0.3%Triton 穿透10min，再加入BSA 封閉液，37℃烘箱封閉1h。加入CaMKⅡ抗體(1∶200)4℃過夜。第二天經PBS 洗滌后加入488 標記的驢抗兔IgG（二抗，1:500）37℃烘箱避光孵育2h。PBS 洗滌后，使用抗熒光淬滅封片液封片。200倍鏡下以左側海馬為觀察部位，在相同條件下，拍照采集圖片。用ImageJ 圖像分析軟件對CaMKⅡ免疫熒光圖片進行分析，計算CaMKⅡ平均光密度。

1.5.4 Western Blot 推拿干預14 天后每組取4 只大鼠，麻醉后斷頭處死，迅速取出左側海馬放入EP 管中，-80℃冰箱保存。稱重后加入相應裂解液，離心取上清液。BCA 法測定蛋白濃度，樣品用12%凝膠濃度進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜至PVDF 膜、牛奶封閉1h，加入SYP 抗體（1:1000）搖床4℃過夜。TBST 洗滌后加入二抗（驢抗兔IgG，1:5000），室溫搖床2h。PVDF 膜放入顯色液后進行圖像掃描，使用Image Lab 軟件對實驗結果進行分析，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白相對灰度值。

1.6 統計方法 采用SPSS23.0 統計軟件，實驗數據以均數±標準差（±s）表示。行為學數據采用重復測量數據的方差分析。其余數據采用Oneway-ANOVA（單因素方差分析）分析組間差異，方差齊用LSD 法，方差不齊用Games Howell法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學結果CCI 術后，模型組大鼠出現跛行，右后足呈明顯跖屈與外翻畸形，且常見舔舐、懸空等后肢保護現象，對機械刺激敏感。經推拿治療后，大鼠跛行與足跖屈、外翻畸形有所改善，偶見右后肢保護現象，對機械痛刺激敏感性有所下降。如圖1 所示，各組大鼠在造模前PWT 均無差異（P＞0.05），空白組與假手術組PWT 術后均無差異（P＞0.05），與假手術組相比，模型組術后第4-18 天PWT出現明顯下降（P＜0.001），與模型組相比，推拿組PWT逐漸升高，術后第10-18天差異明顯（第10天P＜0.05，第14天P＜0.05，第18天P＜0.01）。

圖1 各組大鼠右后足PWT值變化(g)

2.2 形態學結果HE 染色 從圖2 可見，空白組與假手術組海馬神經元排列整齊，形態結構較為完整。與空白組及假手術組相比，模型組海馬神經元損傷，排列紊亂，結構松散，細胞固化萎縮明顯；相比模型組，推拿組在一定程度上恢復了神經元的損傷，神經元排列有序，結構完整，細胞固化與萎縮減輕，具有顯著效果。

圖2 各組大鼠海馬HE染色結果（×400）

2.3 免疫熒光染色 如圖3 所示，海馬區CaMKⅡ主要表達于神經元細胞膜?？瞻捉M與假手術CaMKⅡ陽性表達無差異（P＞0.05）。與空白組和假手術組相比，模型組大鼠海馬的CaMKⅡ陽性表達明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，推拿組海馬CaMKⅡ陽性表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 Western Blot 如圖4-5 所示，空白組與假手術組SYP 表達無差異（P＞0.05），與空白組及假手術組相比，模型組大鼠海馬SYP 蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05）；與模型組相比，推拿組大鼠SYP蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠海馬SYP及內參的灰度條帶

圖5 各組大鼠海馬SYP及內參的蛋白表達

3 討論

神經病理性疼痛是一種以自發性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏為特征的慢性疼痛，發病機制較為復雜。研究發現，持續的傷害性刺激可引起脊髓背角突觸結構和功能的改變，這些可塑性變化可導致脊髓背角中樞敏化，從而維持神經病理性疼痛的發生[14]。突觸可塑性包含結構可塑性與功能可塑性，主要表現為突觸傳遞的長時程增強（long-term poten‐tiation,LTP），均與疼痛密切相關。突觸是兩個神經元相互接觸并能傳遞信息的結構，主要由突觸前部（突觸前膜與突觸囊泡）、突觸間隙（其中包含大量神經遞質）以及突觸后膜（由細胞骨架蛋白與調節蛋白組成）構成[15]。CaMKII是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在突觸前后膜均有廣泛表達，CaMKII可通過調節神經元的興奮性，調控突觸傳遞和突觸可塑性，從而對疼痛產生影響[16]。研究發現突觸前膜的CaMKⅡ通過調控靶點的磷酸化促進興奮性遞質的釋放，使其作用于突觸后膜的NMDA受體，進而激活CaMKⅡ，從而誘導突觸后膜的長時程增強與突觸結構重塑[17]。突觸素（synaptophysin,SYP）是一種位于突觸前膜，并能與突觸囊泡相互聯系的鈣結合蛋白，在神經遞質釋放及囊泡再循環的過程中發揮重要作用[18]，同時突觸素也直接參與了突觸的形成與調節，是突觸可塑性的重要標志[19]。經典的理論認為CaMKⅡ與突觸囊泡相接后，可提高突觸素與突觸囊泡的結合力，從而調節突觸可塑性[20]。由此可見，CaMKⅡ與SYP在突觸可塑性中發揮重要作用。

本團隊在前期研究中發現，CCI大鼠出現脊髓背角突觸間隙變窄、突觸前膜活性帶長度增加及突觸后膜致密物變厚等結構變化[21]，同時也出現明顯LTP增強現象[11]，這說明CCI大鼠脊髓背角發生結構與功能可塑性。推拿不僅緩解CCI 大鼠疼痛，同時也逆轉了這些突觸可塑性改變，意味著推拿通過調控脊髓背角突觸可塑性發揮鎮痛作用。目前推拿鎮痛機制研究主要圍繞外周與脊髓[22,23]，但疼痛并非簡單的外周與脊髓水平傷害性刺激的直接產物，更有可能是由高級中樞對傷害性刺激信號整合、處理而產生的。海馬作為邊緣系統的重要組成之一，不僅接受疼痛信息的傳入，還能處理整合疼痛信息，調節疼痛所引起的機體反應，參與了神經病理性疼痛的發生發展[24]。研究發現周圍神經損傷后，大鼠的海馬的長時程增強（LTP）受損[25]，并出現樹突棘萎縮，樹突分支數目減少以及突觸后致密物變薄、活性帶長度縮短等突觸結構可塑性的表現[10,26]，這表明海馬突觸可塑性同樣參與了神經病理性疼痛狀態的形成與維持?；诖耍覀冞x擇了海馬作為推拿鎮痛機制進一步研究對象。

慢性疼痛可誘導脊髓背角突觸長時程增強，但對海馬區LTP 有損害作用。同時海馬樹突長度和棘突密度顯著減少，脊髓背角樹突長度和密度顯著增加[27]。另有研究發現疼痛大鼠脊髓背角突觸相關蛋白CaMK Ⅱ和SYP 表達增加[7-8]，在海馬中表達減少[9-10]，這表明神經病理性疼痛模型中，海馬突觸可塑性減弱，脊髓背角突觸可塑性增強，疼痛導致脊髓背角與海馬突觸可塑性發生完全相反的變化。本研究采用慢性壓迫性損傷模型來模擬腰椎間盤突出癥神經性疼痛，該模型利用羊腸線對坐骨神經進行機械性壓迫，造成慢性神經損傷，這種神經損傷能夠保持穩定的疼痛狀態，非常接近于臨床上腰椎間盤突出壓迫周圍神經引起下肢放射痛的病理過程[28]。

腰椎間盤突出癥中醫稱為“腰痛病”，并將其歸于“經筋”病范疇。經筋功能失常表現如《素問·長刺節論》所云：“病在筋，筋攣節痛，不可以行，名為筋痹”即肢體疼痛、活動不利等，這與腰椎間盤突出癥臨床表現吻合。中醫認為腰痛病病機主要包括“不通則痛”與“不榮則痛”，并在《素問·血氣形志篇》與《素問·調經》中提到“……經絡不通，病生于不仁，治之以按摩醪藥”及“神不足者，視其虛絡，按而致之，……以通其經，神氣乃平”等治療方法，由此可見中醫推拿治療“經筋”疾病有著悠久的歷史。目前推拿也已廣泛應用于腰椎間盤突出癥的治療，主要包括按揉法、推法、拿法和點法等[29]，均能明顯緩解疼痛，有著具有顯著的臨床療效[30]。慢性壓迫性損傷模型是對于坐骨神經的直接壓迫，長期的壓迫又致神經所支配區域氣血失于濡養，因此，本病病機同時包含“不通則痛”與“不榮則痛”，通過對疼痛部位的點按、按揉，推拿可發揮疏經通絡、促進運行氣血的功效，從而達到“通則不痛”、“榮則不痛”鎮痛作用[31-32]。

本研究結果顯示，CCI手術可導致大鼠出現疼痛行為，降低機械足反射閾值，推拿可緩解大鼠疼痛行為（P＜0.05），升高大鼠機械足反射閾值（P＜0.05），這與我們前期研究一致[32]；HE 染色下觀察到空白組與假手術組大鼠左側海馬神經元排列整齊，形態完整且飽滿，CCI 造模后海馬神經元結構破壞明顯，排列紊亂，細胞固化萎縮，經推拿治療后，神經元形態結構有明顯改善，排列趨于整齊，由此可推斷推拿可保護CCI 大鼠海馬神經元，減少神經元損傷；神經元之間通過突觸聯系，神經元的變化與突觸相關蛋白密切相關。模型組大鼠海馬CaMKII 與SYP 蛋白表達明顯下降（P＜0.05），提示CCI會導致海馬突觸可塑性降低，這與之前的研究一致[33]；推拿治療可使海馬CaMKII 與SYP 蛋白表達明顯上升（P＜0.05），即增強了這兩個蛋白的活性，鑒于這兩個蛋白對于突觸可塑性的重要意義，我們推測認為推拿可使海馬CaM‐KII 與SYP 表達上調，加強了海馬突觸之間的聯系，從而改善海馬突觸可塑性，達到鎮痛的效果。

綜上所述，推拿鎮痛機制可能是通過上調海馬CaMKII與SYP表達，改善海馬突觸可塑性而起效。