LC-MS/MS法測定大鼠血漿中亞胺培南濃度及其藥動學研究*

錢敏燕，楊旭萍，蔣振偉，左李安，胡楠，王莉英

蘇州大學第三附屬醫院/常州市第一人民醫院 藥學部，常州213003

亞胺培南（imipenem，IMP）是碳青霉烯類β-內酰胺類抗生素，對大多數革蘭氏陰性、革蘭氏陽性菌及厭氧菌具有抗菌活性[1]，與去氫肽酶抑制劑西司他丁聯合使用可防止IMP 被腎臟脫氫肽酶Ⅰ（dehydropeptidase Ⅰ，DHP-Ⅰ）代謝[2]。作為時間依賴性抗菌藥，IMP 游離藥物濃度超過最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的給藥間隔決定了其療效，保持適當的藥物濃度高于MIC 的時間（T ＞MIC）可達到最佳的抗菌效果[3]。

目前測定血漿中IMP 濃度的方法包括HPLC法和液相色譜串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[4，5]。測定體內化合物時LC-MS/MS 法具有選擇性好、靈敏度高以及分析時間短的優點。已有文獻報道IMP 在不同種屬體內的藥代動力學參數[6，7]，給予不同劑量的IMP會對大鼠的腎臟產生損傷[8]，但目前有關不同劑量IMP 在大鼠中的藥動學研究較少。本研究考察了3種不同劑量IMP 在SD 大鼠體內的藥動學，為IMP相關研究提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 藥品及試劑

注射用亞胺培南西司他丁鈉（規格1 g，批號U035144，杭州默沙東有限公司），亞胺培南對照品（純度98%，批號PNJX200214，深圳大力水手生物科技有限公司），法羅培南（faropenem，FARO）對照品（純度80.3%，批號130532-201301，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（LC 級，批號JB091230，美國Merck公司），甲酸（純度95%，批號SHBL0331）、乙酸銨（純度98%，批號BCCB9398）購于德國Sigma 公司。

1.2 儀器

Triple QuadTM4500MD 三重四級桿串聯質譜儀，Jasper 高效液相色譜系統（美國SCIEX 公司）；低溫高速離心機5417R（德國Eppendorf 公司）；Vortex-Genie2 渦旋震蕩儀（美國Scientific Industries 公司）；BT25S 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；Milli-Q 純水儀（美國Merck 公司）。

1.3 動物

18 只雄性SD 大鼠，體重300 g 左右，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（蘇）2021-0013。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex?HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，2.6 μm）；流動相A：含0.1%甲酸和5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～0.7 min，95%B；0.7～1 min，95%→40%B；1～2.5 min，40%B；2.5～2.7 min，40%→95%B；2.7～5 min，95%B；流速：0.4 mL·min-1；進樣器溫度：4℃；柱溫：40℃；進樣體積：5 μL。

2.2 質譜條件

質譜條件：電噴霧離子化電離源（electrospray ionization，ESI），掃描方式為多重反應監測（multiple response monitoring，MRM），正離子模式；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度：500℃；霧化氣（GS1）：344.7 kPa；輔助氣（GS2）：344.7 kPa；氣簾氣（curtain gas）：206.8 kPa；亞胺培南、內標法羅培南離子對分別為m/z→300.0/142.0，m/z→308.0/182.0；解簇電壓分別為55、53 eV；碰撞能量分別為21、24 eV。

2.3 溶液配制

稱取IMP 對照品適量，精密稱定，甲醇定容得1.00 mg·mL-1的IMP 儲備液，分裝后置于-80℃冷凍保存。

稱取FARO 對照品適量，精密稱定，甲醇定容得0.50 mg·mL-1內標儲備液，稀釋得50.0 μg·mL-1的內標工作液，分裝后置于-80℃冷凍保存。

2.4 標準曲線和質控樣品制備

用甲醇稀釋IMP 儲備液得2、5、10、20、50、100、200、500、1000 和2000 μg·mL-1的標準品溶液。另稀釋IMP 儲備液得定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）質控溶液（0.2 μg·mL-1）及低、中、高濃度質控溶液（3、150、1500μg·mL-1）。取45 μL血漿，加入5 μL 上述不同濃度的IMP 標準品溶液和質控溶液，得到終濃度為0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·mL-1的系列標準血漿樣品，LLOQ 濃度（0.02μg·mL-1）以及低、中、高濃度（0.3、15.0 和150.0 μg·mL-1）的質控血漿樣品。

2.5 血漿樣本前處理

取血漿50 μL，加入5 μL 內標FARO（50 μg·mL-1），再加入150 μL 乙腈，渦旋振蕩3 min，以16 400 r·min-1離心10 min，取上清液進樣分析。樣本從-80℃取出到處理完成至進樣過程控制在2 h 內。

2.6 方法學驗證

2.6.1 專屬性 空白血漿、含FARO 的空白血漿、含IMP 標準品及FARO 的空白血漿以及給藥10 min后大鼠血漿樣品，均按“2.5”項下方法處理后進樣分析，色譜圖見圖1。IMP 和FARO 的保留時間分別為2.40、1.14 min，血漿中雜質和內源性物質在IMP 保留時間內無干擾，說明該方法專屬性良好。

圖1 血漿樣品亞胺培南與法羅培南的LC-MS/MS 色譜圖

2.6.2 標準曲線和定量下限 取“2.4”項下制備的系列標準血漿樣品，按“2.5”項下處理后進樣，建立線性回歸的標準曲線。待測物與內標物峰面積比Y為縱坐標，待測物濃度X（μg·mL-1）為橫坐標，使用加權（W=1/X2）最小二乘法進行線性回歸運算，得直線回歸方程；采用內標法對IMP 進行定量。結果表明，IMP 在0.2～200 μg·mL-1內線性關系良好，直線回歸方程為Y=2.44×10-3X-1.66×10-4，r2=0.996。LLOQ 為0.2 μg·mL-1（S/N ＞10）。

2.6.3 準確度和精密度 取“2.4”項下制備的LLOQ血漿樣品（0.02 μg·mL-1）和低、中、高（0.3、15.0 和150.0 μg·mL-1）濃度的質控血漿樣品各5 份，按“2.5”項下進行處理后進樣分析，連續測定3 d，計算批內（n=5）和批間（n=3）精密度，結果見表1。

表1 亞胺培南測定方法的準確度以及精密度RSD（%）

2.6.4 基質效應和提取回收率 分別取50 μL 純水和不同來源的空白血漿6 份，加入150 μL 乙腈沉淀，渦旋后分別加入“2.4”項下低、中、高濃度質控溶液（3、150、1500 μg·mL-1）和內標溶液，混勻后進樣分析，記錄純水樣本峰面積As和內標峰面積Ai之比（A），記錄血漿樣本峰面積A′s和內標峰面積A′i之比（B）。以峰面積比值計算基質效應，基質效應（%）=B/A×100%。

取50μL 不同來源的空白血漿6 份，加入150μL乙腈沉淀，渦旋離心后取上清，分別加入低、中、高濃度質控和內標溶液（使其濃度與低、中、高質控血漿樣本濃度相同），混勻后進樣分析，記錄低、中、高濃度樣本峰面積As和內標峰面積Ai之比（C）；取“2.4”項下低、中、高濃度質控溶液（3、150、1500 μg·mL-1），按“2.5”項下處理6 份樣品，進樣得到低、中、高濃度樣本峰面積A′s和內標峰面積A′i之比（D）。以峰面積比值計算提取回收率，提取回收率（%）=C/D×100%。

QC 樣品的基質效應為91.3%～104.6%，提取回收率為88.9%～101.6%，滿足生物樣品的分析要求。

2.6.5 稀釋可靠性 取“2.4”項下低、中、高濃度的質控血漿樣品各5 份，再用空白血漿稀釋2 倍（稀釋后的理論質量濃度為0.15、7.5 和75 μg·mL-1）后，按“2.5”項下處理后進樣以考察稀釋可靠性。經稀釋后低、中、高濃度的質控血漿樣品的準確度分別為（101.2±4.4）%、（98.0±11.8）%和（88.3±5.2）%，RSD分別為8.7%、12.1%和3.4%。

2.6.6 穩定性 取“2.4”項下低、中、高濃度的質控血漿樣品5 份，考察樣品在常溫2 h，4℃放置4 h、-80℃凍融3 個循環、-80℃凍存10 d 以及處理后在自動進樣器中放置4 h 的穩定性，結果見表2。

表2 亞胺培南測定方法的穩定性（n=5）

2.7 藥動學研究

18 只雄性SD 大鼠分為3 組，每組6 只，注射用亞胺培南西司他丁鈉用適量生理鹽水溶解后，分別按50、100、200 mg·kg-1的劑量腹腔注射（intraperitoneal injection，ip），并于給藥后10、20、40、50、60、75、90、120、240、360 min 從眼底靜脈叢采血200 μL，置于肝素化離心管中，采血后立即以3000 r·min-1離心5 min，取上清50 μL 于-80℃保存，待測。測樣時將樣品置于4℃冰箱中解凍，按“2.4”項下處理后進樣分析。200 mg·kg-1給藥的大鼠血漿樣品濃度超出標準曲線線性范圍，加入等量大鼠空白血漿稀釋，按“2.4”項下處理后進樣分析。

所得數據用Winnonlin 6.0 軟件處理，采用非房室模型計算藥動學參數。SD 大鼠腹腔注射50、100和200 mg·kg-1IMP 后的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，主要藥動學參數見表3。

圖2 SD 大鼠腹腔注射IMP 后的平均血藥濃度-時間曲線

表3 SD 大鼠腹腔注射IMP 后主要藥動學參數（n=6）

3 討論

反相色譜柱對極性化合物的保留能力弱，因IMP為強極性化合物在反相色譜上常出現色譜峰拖尾的問題[9]。HILIC 色譜柱所用的流動相與反相色譜柱相似，但其極性固定相對親水化合物的保留能力強于反相色譜柱，適用于分離強極性和親水性化合物[10]。在HILIC 色譜中乙腈分離IMP 的效果比甲醇好，選用乙腈-水作為流動相時發現IMP 的響應偏低且峰型較差，故嘗試在流動相中加入酸和揮發鹽。結果發現在水相加入甲酸可提高IMP 的響應，加入乙酸銨可改變峰型，因此選擇0.1%甲酸和5 mmol·L-1乙酸銨作為流動相進行梯度洗脫。

IMP 在生物樣本中不穩定，此外pH 值和溫度對其穩定性影響較大[11]；在偏堿性或酸性的條件下易生成開環降解產物；pH=1 時，高濃度IMP 還會降解生成穩定的二酮哌嗪結構化合物[12]。在IMP 檢測相關文獻中，常加入2-（N-嗎啡啉）乙磺酸[2-（N-morpholine）ethylene sulfonic acid，MES] 或3-嗎啉丙磺酸（3-morpholino propanesulfonic acid，MOPS）等非親核試劑作為穩定劑[4，13]以提高其穩定性。但長期使用穩定劑會降低質譜靈敏度，對質譜造成損傷[14]。本文也考察了操作過程中影響IMP 穩定性的因素，不同條件下的穩定性均在可接受范圍內，因此在本研究未使用穩定劑。在整個實驗過程中需控制處理溫度和時間以減少IMP 的降解，取血后需立即離心取上清置于-80℃中保存。另有研究顯示未使用穩定劑的IMP 血漿樣品（30 mg·L-1）可在室溫下放置2 h、4℃下放置4 h 或-70℃下儲存6個月[13]。

在臨床劑量范圍內IMP 的藥代動力學是線性的[15]，本研究發現各組大鼠的Cmax（r=0.916，P ＜0.01）和AUC0-t（r=0.961，P＜0.01）與劑量呈線性相關。參考大鼠靜脈注射（intravenous injection，iv）IMP（50 mg·kg-1）后所得AUC0-∞（7 713.89±2 608.39）μg·min·mL-1[16]，結合本研究的AUC 數據，計算得到絕對生物利用度為68.2%，與IMP 肌肉注射的生物利用度（70%～80%）[17]接近。Peng L等[16]研究了SD 大鼠經靜脈注射IMP（50 mg·kg-1）的藥動學參數，CL（0.007±0.002）mL·min-1·g-1、Vd（0.319 ± 0.18）mL·g-1、t1/2（29.295±12.972）min 及MRT0-∞（48.457±9.18）min與本研究結果較為一致，但AUC0-∞（7 713.89 ±2 608.39）μg·min·mL-1、Cmax（180.5±64.859）μg·mL-1和tmax（2.5±1.22）min 存在差異，因為ip 給藥后藥物需經腹膜吸收入血后再分布至全身。與本研究結果相比，Boulamery A等[18]研究了Wistar 大鼠給予IMP（im 140 mg·kg-1）的藥動學參數，AUC0-∞（177.38±24.58）μg·h·mL-1和Cmax（85.94±19.71）μg·mL-1偏低，CL/F（0.27±0.04）L·h-1、t1/2（0.92±0.24）h 和V/F（0.37±0.13）L 可能是肌肉注射使IMP 的釋放延長[19]。綜上所述，本文建立了一種LC-MS/MS 法測定大鼠血漿中IMP 的濃度，比較了3 種不同劑量IMP在SD 大鼠體內的藥動學參數，可以為IMP 在大鼠中的相關研究提供參考依據。