甲氨蝶呤的合成工藝改進

朱海溪，李靖*，劉美朝，陳彬，田帥華

1江蘇奧賽康藥業有限公司，南京 211112;2南京醫科大學 藥學院，南京211166

甲氨蝶呤（methotrexate，1）作為一種抗葉酸類藥物，在腫瘤、類風濕性關節炎等疾病中有良好的療效[1]。目前，文獻報道用于生產甲氨蝶呤的方法主要以N-[4-（甲氨基）苯甲酰基]-L-谷氨酸-1，5-二乙酯（4）和6-溴甲基-2，4-蝶啶二胺氫溴酸鹽（5）為起始原料，經取代反應得到（2S）-2-[[4-[[（2，4-二氨基蝶呤-6-基）甲基]甲氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸二乙酯（6），再經水解得到[2]，合成路線見圖1。

圖1 甲氨蝶呤的合成路線

該路線操作簡單、收率較高，但存在兩個問題：一是5活性高（易降解）、純度偏低（含有機雜質約8%～9%）；二是在合成6的過程中，碳酸鉀與氫溴酸反應生成水，蝶啶環頂端的氨基發生水解，易產生雜質C前體，并衍生為成品中的雜質C（圖2）[3]，難以去除（按圖1 所示方法，得到6的純度為88.58%，其中雜質C前體含量為3.58%；繼續合成甲氨蝶呤，其純度為98.84%，其中雜質C含量為0.78%）。目前，雜質C在甲氨蝶呤原料藥美國藥典USP40 及歐洲藥典EP10.0 中的限度為≤0.5%[4，5]，因此需要嚴格控制中間體和成品的質量。

圖2 雜質C 和雜質C 前體結構式

經檢索[6，7]，目前尚無6的純化方法報道。本文在圖1 的基礎上，優化了合成路線，并開發了6的精制方法（圖3）。即以4-甲氨基苯甲酸（2）、L-谷氨酸-1，5-二乙酯鹽酸鹽（3）為原料，經縮合反應得到N-[4-（甲氨基）苯甲酰基]-L-谷氨酸-1，5-二乙酯（4）[8]，4與6-氯甲基-2，4-蝶啶二胺鹽酸鹽（5′）在溴化鈉作用下反應得到（2S）-2-[[4-[[（2，4-二氨基蝶呤-6-基）甲基]甲氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸二乙酯（6）[2]，6溶于N，N-二甲基乙酰胺中，攪拌下滴加對甲苯磺酸水溶液進行析晶，得到其對甲苯磺酸鹽（6′），6′在氫氧化鈉水溶液中脫去乙基得到甲氨蝶呤二鈉（7），通過調節pH 可析出甲氨蝶呤（1）。新的合成路線能夠降低6及6′中雜質C前體的含量，進而降低甲氨蝶呤中雜質C的含量。

圖3 甲氨蝶呤新合成路線

2 合成實驗

2.1 儀器與試劑

JY10002 電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；DF-101s 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；RAT-50D 玻璃反應釜（上海申順生物科技有限公司）；LB-450 離心機（江蘇賽德力制藥機械制造有限公司）；FZG-15 方形真空干燥機（常州成博制藥機械廠）。

4-甲氨基苯甲酸（2，南京況哲醫藥科技有限公司），L-谷氨酸-1，5-二乙酯鹽酸鹽（3，山東鉑源藥業有限公司），6-溴甲基-2，4-蝶啶二胺氫溴酸鹽（5，上海贏瑞生物醫藥科技有限公司），6-氯甲基-2，4-蝶啶二胺鹽酸鹽（5′，廣安百泉醫藥科技有限公司），其他試劑、溶劑均為市售分析純。

2.2 化合物4 合成與確證

向50 L 玻璃反應釜中依次加入乙腈（8.32 kg）、N，N-二甲基甲酰胺（0.29 kg）、2（1.5 kg，9.92 mol），攪拌下降溫至（5±5）℃；加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪（1.74kg，9.92mol）和N-甲基嗎啉（3.01kg，29.76 mol），（0±5）℃反應1 h 后加入3（2.38 kg，9.92 mol），室溫反應4 h 后過濾，向濾液中滴加純化水（52.5 L）析晶，過濾干燥后得白色固體4（2.68 kg，收率約80.2%），熔點（mp）88～89℃。HPLC 純度為99.28%，ESI-MS：m/z 337.1758 [M+H]+，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：8.228（d，J=7.5 Hz，1H），7.678（d，J=9.0 Hz，2H），6.530（d，J=8.5 Hz，2H），6.247-6.218（m，1H），4.403-4.359（m，1H），4.114-4.02（m，4H），2.715（d，J=5.0 Hz，3H），2.430-2.400（m，2H），2.096-2.054（m，1H），2.016-1.995（m，1H），1.195-1.151（m，6H）。

2.3 雜質C 前體合成與確證

向500 mL 三頸瓶中依次加入“2.2”中4（54.6 g，162.3 mmol）、N，N-二甲基乙酰胺（270 mL），升溫攪拌溶解。待溶液澄清后，加入5[69.4 g，含量78.6%（約含12%～13%左右的甲酰胺溶劑、8%～9%的有機雜質），162.3mmol]，55～60℃反應2h。降溫至（25±5）℃后，將反應液轉移至2 L 三口瓶中，滴加1.35 L純化水，攪拌析晶過夜。過濾干燥后得棕褐色固體66 g，即化合物6，收率約70.6%，HPLC 純度為88.58%，雜質C前體含量3.58%（LC-MS 提取分子量512）。取出部分化合物3，經制備液相提取、純化，得到雜質C前體1.1 g，mp 170～172℃，HPLC純度為99.0%[色譜柱為ACE Excel 5 Super C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為3.4 g·L-1無水磷酸二氫鈉溶液（用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH 值至6.0）-乙腈（95∶5）；流動相B 為乙腈；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25℃；檢測波長為260 nm；出峰時間為15.823 min]。ESI-MS：m/z 512.15[M+H]+；1HNMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：11.4506（s，1H），8.4972（s，1H），8.3182（d，J=7.48Hz，1H），7.7258（d，J=8.88Hz，2H），6.8076（brs，1H），6.7964（d，J=9.00 Hz，2H），4.7948（s，2H），4.4131-4.3578（m，1H），4.1157-4.0116（m，4H），3.1981（s，3H），2.4274-2.3900（m，2H），2.1060-1.9413（m，2H），1.1936-1.1398（m，6H）。

2.4 雜質C 合成與確證

向50mL 反應瓶中加入“2.3”中雜質C前體（1g，1.95 mmol）、純化水10 mL，攪拌下滴加10%左右的氫氧化鈉（0.3 g，7.5 mmol）水溶液3 mL，滴畢后使內溫在（15±5）℃反應1.5 h。過濾，向濾液中滴加39 mL丙酮，析出固體。過濾，濾餅用10 mL 純化水溶解，5%硫酸調節pH 值至4.0～4.5，析出固體，過濾干燥后得到雜質C約0.67 g，收率約75.4%，mp 183℃～184℃，HPLC 純度為98%[色譜柱為Waters Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為3.4 g·L-1無水磷酸二氫鈉溶液（用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH 值至6.0）-乙腈（95∶5）；流動相B 為3.4 g·L-1無水磷酸二氫鈉溶液（用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH 值至6.0）-乙腈（50∶50）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為280 nm；出峰時間為6.980 min]。ESI-MS：m/z 454.1507[M-H]-，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：12.283（s，1H），11.458（s，1H），8.493（s，1H），8.208（d，J=8.0 Hz，1H），7.729（d，J=8.5 Hz，2H），6.893（s，1H），6.791（d，J=9.0 Hz，2H），4.790（s，2H），4.374-4.329（m，1H），3.193（s，3H），2.325（t，J=7.5 Hz，2H），2.076-2.039（m，1H），1.941-1.894（m，1H）。

2.5 化合物6 合成與確證

向反應釜中依次加入N，N-二甲基乙酰胺（10.97 kg）、“2.2”中化合物4（2.6 kg，7.73mol），攪拌下升溫，待內溫升至45℃后加入溴化鈉固體（1.08kg，10.55 mol）和5′（2.09 kg，7.03 mol），保溫60℃反應19 h。降溫至（20±5）℃后滴加純化水（58.4 L），攪拌析晶1 h，離心干燥后得到棕褐色固體6（3.2 kg，收率約81.0%），mp 177～179℃。HPLC 純度約93.30%，雜質C前體含量約2.41%。

2.6 化合物6 純化條件的考察

以“2.5”中化合物6為粗品，改變良性溶劑（溶解化合物6）種類、一水合對甲苯磺酸的用量，考察雜質C前體的精制效果，結果見表1。

從表1 可以看出，使用N，N-二甲基乙酰胺/對甲苯磺酸水體系、N，N-二甲基甲酰胺/對甲苯磺酸水體系、乙醇/對甲苯磺酸水體系均可以對化合物6起到精制效果；增加一水合對甲苯磺酸的用量，可以提高雜質C前體的清除效果、提高收率，但增加到1.2 eq 后達到平臺。相比于乙醇，N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺是更優的良性溶劑。考慮到ICH Q3C 指南中N，N-二甲基乙酰胺的毒性更小，故選擇N，N-二甲基乙酰胺/對甲苯磺酸水體系、一水合對甲苯磺酸用量為6的1.2 eq 為精制條件。

表1 化合物6 純化條件的考察

2.7 化合物6′合成與確證

按照“2.6”中優化后的條件，向500 mL 反應瓶中加入N，N-二甲基乙酰胺（100 mL）、“2.5”中化合物6（20 g，39.2 mmol），攪拌溶解。室溫下滴加對甲苯磺酸水溶液[8.9 g（46.8 mmol）一水合對甲苯磺酸溶于300 mL 水中]。滴畢后攪拌析晶1 h，過濾干燥后得橙黃色固體6′（22.7 g，分子量：682.75，收率約85.0%），mp 185～186℃，HPLC 純度96.62%，雜質C前體含量0.15%。ESI-MS：m/z 511.2387[M+H]+，1HNMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：12.896（s，1H），9.290（s，1H），9.078（s，1H），8.728（s，1H），8.620（brs，1H），8.343（d，J=7.5 Hz，1H），7.745（d，J=8.5 Hz，2H），7.546（brs，1H），7.497（d，J=8.0 Hz，2H），7.121（d，J=7.5 Hz，2H），6.828（d，J=9.0 Hz，2H），4.880（s，2H），4.396-4.374（m，1H），4.101-4.016（m，4H），3.257（s，3H），2.405（t，J=8.0 Hz，2H），2.289（s，3H），2.099-2.060（m，1H），1.997-1.979（m，1H），1.187-1.141（m，6H）。

2.8 甲氨蝶呤二鈉（7）合成與確證

依次向250 mL 反應瓶中加入純化水98 mL、“2.6”中化合物6′（20 g，29.3 mmol），攪拌下滴加氫氧化鈉（4.7 g，117.5 mmol）水溶液43 mL。滴畢后控溫（15±5）℃反應1.5 h，反應結束后過濾，濾液轉至1 L反應瓶中，攪拌下滴加丙酮423 mL 析晶。過濾干燥后得到黃色固體7（11.1 g，收率76.0%），HPLC 純度為99.77%，ESI-MS：m/z 455.1763 [M-2Na+3H]+，1HNMR（500 MHz，CD3OD）δ：8.557（s，1H），7.777（t，J=7.5 Hz，2H），6.855-6.826（m，2H），4.812（s，2H），4.404-4.379（m，1H），3.209（s，3H），2.356-2.289（m，1H），2.277-2.204（m，2H），2.128-2.100（m，1H）。其中，雜質C含量約為0.07%。

2.9 甲氨蝶呤（1）合成與確證

向250 mL 反應瓶中加入“2.7”中化合物7（10 g，20.1 mmol）、純化水100 mL，攪拌溶清后用5%硫酸溶液調節pH 至4.0～4.5，過濾干燥后得到黃色固體1（8.2 g，收率 約90%），mp 194～195℃，純 度99.79%，雜質C含量約為0.08%[色譜柱為Waters Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為3.4 g·L-1無水磷酸二氫鈉溶液（用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH 值至6.0）-乙腈（95∶5）；流動相B為3.4 g·L-1無水磷酸二氫鈉溶液（用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH 值至6.0）-乙腈（50∶50）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為280 nm]。ESI-MS：m/z 455.1791[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.5852（s，1H），8.1994（d，J=7.68 Hz，1H），7.7403（d，J=8.92 Hz，3H），7.5112（brs，1H），6.8327（d，J=9.04 Hz，2H），4.7934（s，2H），4.3879-4.3323（m，1H），3.2160（s，3H），2.3337（t，J=7.44 Hz，2H），2.0902-2.0429（m，1H），1.9562-1.8978（m，1H）。13C-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：174.0266（4°），173.8874（4°），166.3616（4°），162.7369（4°），154.8895（4°），150.9637（4°），149.1915（3°），146.2206（4°），128.9456（3°），121.4562（4°），111.0785（3°），54.8804（2°），51.8315（3°），38.8905（1°），30.5046（2°），26.0930（2°）。

3 結論

與使用圖1 所示方法得到的甲氨蝶呤（純度98.84%，雜質C含量為0.78%）相比，使用優化后的合成路線和精制方法，6′中雜質C前體的含量由6中的2.41%（合成實驗“2.5”）降低至0.15%（合成實驗“2.7”），繼續向后反應得到甲氨蝶呤，其純度為99.79%，雜質C的含量為0.08%（合成實驗“2.9”），符合USP40 及EP10.0 對原料藥的要求。