PRMT7抑制前列腺癌細(xì)胞體外遷移和侵襲的研究

胡 平, 何燕燕, 孫馨悅, 王建軍, 陳 平*

(1.同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,上海 200092; 2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院病理科,上海 200072;3.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200123)

前列腺癌是全球男性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤。在2020年,全世界報(bào)道有1 414 259例新診斷的病例,占到所有新診斷癌癥病例的7.3%;375 304例死亡病例,占所有癌癥死亡病例的3.8%[1]。當(dāng)前列腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其他遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移時(shí),其死亡率會(huì)極大增加。因此,理解前列腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于制定治療策略具有重要意義。

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7(protein arginine methyltransferase 7, PRMT7),作為唯一進(jìn)化保守的Ⅲ型酶,只催化產(chǎn)生單甲基精氨酸殘基[2]。PRMT7參與了不同的生物學(xué)過(guò)程,包括DNA損傷修復(fù)[3]、早期胚胎發(fā)育[4]、脂肪形成[5]、成肌細(xì)胞分化[6]、神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)[7]。PRMT7在腫瘤組織中也有表達(dá)。在腎癌患者中,PRMT7在癌組織中的表達(dá)高于非癌組織[8]。在肺癌細(xì)胞中,PRMT7的表達(dá)與侵襲性呈正相關(guān)[9]。在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞中PRMT7表現(xiàn)為高表達(dá)[10]。PRMT7在肝癌癌旁組織的表達(dá)率高于癌組織,在肝癌細(xì)胞系低表達(dá),且PRMT7降低癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[11]。本研究旨在分析PRMT7在前列腺癌組織和前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平、過(guò)表達(dá)PRMT7對(duì)前列腺癌細(xì)胞表型的影響,通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和蛋白測(cè)序初步探索其機(jī)制,進(jìn)一步明確PRMT7在前列腺發(fā)生發(fā)展的作用。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥gtexportal.org/home/)中檢索得到100例正常前列腺組織RNAseq數(shù)據(jù),TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.cancer.gov/)中檢索得到52例正常前列腺組織RNAseq數(shù)據(jù)以及496例前列腺癌組織RNAseq數(shù)據(jù),最終分析的樣本數(shù)目: 正常前列腺組織為152,前列腺癌組織為496。將TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后進(jìn)行樣本間的表達(dá)比較。使用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和可視化。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);胎牛血清、0.25%胰酶、1640培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、Defined Kerntinocyte-SPF培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。雙抗(青霉素、鏈霉素)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。所有細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、1%雙抗的培養(yǎng)基中,并在5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western印跡法

所有細(xì)胞使用RIPA裂解液裂解制備成蛋白懸液,加入上樣緩沖液后制備上樣懸液。一抗、二抗稀釋比為1∶1 000。PRMT7抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,β-actin抗體、GAPDH抗體、MAP2抗體和S100A4抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,KISS1R抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。

1.4 PRMT7過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

將狀態(tài)良好的前列腺癌細(xì)胞傳代至六孔板中,至第2天匯合度達(dá)到40%50%。將病毒濃縮液從-80 ℃拿出放冰上融化,取200 μL病毒濃縮液加入六孔板中,輕輕混勻,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。48 h后,在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),在顯微鏡下觀察感染病毒后細(xì)胞的綠色熒光的比率,加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選,每2天更換1次培養(yǎng)基,培養(yǎng)1周左右后,在熒光顯微鏡下觀察熒光達(dá)到90%時(shí)即構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株成功,后續(xù)降低嘌呤霉素濃度維持培養(yǎng)得到過(guò)表達(dá)PRMT7的LNCaP細(xì)胞株P(guān)RMT7-L和過(guò)表達(dá)PRMT7的PC3細(xì)胞株P(guān)RMT7-P。

1.5 細(xì)胞劃痕

細(xì)胞在六孔板中生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%后,用20 μL移液管尖端借助直尺于六孔板每個(gè)孔劃4條平行線。使用PBS輕柔的洗滌3次,加入無(wú)血清培養(yǎng)基在顯微鏡下觀察確認(rèn)無(wú)懸浮細(xì)胞后,定點(diǎn)在4倍物鏡下拍照。24 h后,再在定點(diǎn)進(jìn)行拍照。

1.6 Transwell遷移

每個(gè)Transwell小室種植50 000細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,使用乙醇固定,結(jié)晶紫染色,使用棉簽擦去未穿過(guò)小室的細(xì)胞后在光學(xué)顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.7 Transwell侵襲

基底膜基質(zhì)(美國(guó)BD公司)用1∶5的培養(yǎng)基稀釋,每個(gè)Transwell小室加入稀釋后的基質(zhì)膠50 μL。每個(gè)Transwell小室種植50 000個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,使用乙醇固定,結(jié)晶紫染色,使用棉簽擦去未穿過(guò)小室的細(xì)胞后在光學(xué)顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.8 轉(zhuǎn)錄測(cè)序和蛋白組分析

在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收取狀態(tài)良好的細(xì)胞沉淀送至公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和Label-free蛋白組分析。P<0.05,|log2FoldChange|>0作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)。P<0.05,FoldChange>1.5篩選出表達(dá)上調(diào)的蛋白;P<0.05,FoldChange<0.67,篩選出表達(dá)下調(diào)的蛋白。

1.9 siRNA轉(zhuǎn)染

將狀態(tài)良好的細(xì)胞傳代至六孔板中使第2天細(xì)胞匯合度達(dá)到70%,每孔換上2 mL新鮮培養(yǎng)基;每個(gè)孔準(zhǔn)備1個(gè)潔凈無(wú)菌的離心管,加入125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),再加入100 pmoL siRNA輕輕吹打混勻后再加入4 μL Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),輕輕吹打混勻。配制完成后,室溫存放6 h內(nèi)穩(wěn)定,取125 μL混合物,均勻滴加到整個(gè)孔內(nèi),隨后輕輕混勻,繼續(xù)培養(yǎng)約23 d后,收取細(xì)胞用Western印跡法檢測(cè)siRNA對(duì)于靶基因的下調(diào)效果。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PRMT7在前列腺組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

通過(guò)檢索GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)得到PRMT 7在正常前列腺組織和前列腺癌組織的表達(dá)水平。PRMT7在正常152例前列腺組織中的轉(zhuǎn)錄水平高于496例前列腺癌組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖1A。本次又檢測(cè)了PRMT7在正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1和4種前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3、22RV1、DU145的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)PRMT7在正常前列腺上皮細(xì)胞的表達(dá)高于前列腺癌組織,表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖1B。

圖1 PRMT7在前列腺癌組織和細(xì)胞系下調(diào)表達(dá)Fig.1 PRMT7 is down-regulated in prostate tissues and cell linesA: 數(shù)據(jù)庫(kù)分析正常前列腺組織和前列腺癌組織中PRMT7的表達(dá),**P<0.01;B: Western印跡法檢測(cè)PRMT7在正常前列腺上皮細(xì)胞和4種前列腺癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平;C: PRMT7在不同細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)柱狀圖,***P<0.001

2.2 PRMT7抑制前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲

通過(guò)慢病毒感染構(gòu)建了雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCaP、雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞PC3穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PRMT7細(xì)胞株。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn),檢測(cè)PRMT7過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的遷移能力的影響,結(jié)果顯示PRMT7抑制前列腺癌細(xì)胞的體外遷移能力(P<0.000 1),見(jiàn)圖2A、B。通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)PRMT7過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力的影響,結(jié)果顯示PRMT7抑制前列腺癌細(xì)胞的體外侵襲能力(P<0.000 1),見(jiàn)圖2C。

圖2 PRMT7抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3遷移和侵襲Fig.2 PRMT7 inhibits the migration and invasion of prostate cancer LNCaP and PC3 cellsA: 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PRMT7對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;B: 細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PRMT7對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;C: 細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PRMT7對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3侵襲的影響(n=3),****P<0.000 1

2.3 PRMT7影響前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平

通過(guò)對(duì)PRMT7過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株LNCaP及其對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq,PRMT7上調(diào)545個(gè)基因轉(zhuǎn)錄,下調(diào)612個(gè)基因轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。GO分析顯示,差異表達(dá)基因富集的信號(hào)通路包括細(xì)胞外基質(zhì),見(jiàn)圖3A。KEGG分析顯示,差異表達(dá)基因富集的信號(hào)通路包括細(xì)胞黏附分子(CAMs),見(jiàn)圖3B。在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因中,PRMT7顯著上調(diào)KISS1R的轉(zhuǎn)錄水平,見(jiàn)圖3C。

2.4 PRMT7影響前列腺癌細(xì)胞的翻譯水平

通過(guò)對(duì)PRMT7過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株LNCaP及其對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行蛋白測(cè)序,PRMT7上調(diào)17個(gè)蛋白,下調(diào)22個(gè)蛋白的表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖3D。上調(diào)最顯著的蛋白是MAP2,它與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān),見(jiàn)圖3E。Western印跡法結(jié)果顯示,LNCaP和PC3細(xì)胞中MAP2表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)PRMT7通過(guò)RNA測(cè)序在LNCaP細(xì)胞中下調(diào)S100A4的表達(dá)(P<0.01);通過(guò)Western印跡法檢測(cè)LNCaP細(xì)胞中S100A4的水平;在PC3中,觀察到同樣的趨勢(shì),S100A4表達(dá)下調(diào),見(jiàn)圖3F。

圖3 PRMT7影響前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平Fig.3 PRMT7 affectes transcription and protein levels in prostate cancer cellsA: 差異基因GO功能分析 ;B: 差異基因KEGG功能分析;C: 轉(zhuǎn)錄測(cè)序檢測(cè)KISS1R基因轉(zhuǎn)錄水平,*P<0.05;D: 蛋白測(cè)序差異蛋白熱圖;E: 蛋白組分析檢測(cè)MAP2蛋白表達(dá)水平,*P<0.05;F: Western印跡法檢測(cè)在過(guò)表達(dá)PRMT7穩(wěn)轉(zhuǎn)株中與前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

2.5 PRMT7調(diào)控下游蛋白KISS1R的表達(dá)

為了研究KISS1R是否能挽救PRMT7對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用,在PRMT7-L和PRMT7-P中敲低KISS1R蛋白。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn),檢測(cè)在PRMT7-L和PRMT7-P細(xì)胞株中敲低KISS1R對(duì)前列腺癌細(xì)胞的遷移能力的影響,結(jié)果顯示siKISS1R能夠逆轉(zhuǎn)PRMT7抑制前列腺癌細(xì)胞的體外遷移能力(P<0.000 1),見(jiàn)圖4A、B。通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)在PRMT7-L和PRMT7-P細(xì)胞株中敲低KISS1R對(duì)前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力的影響,結(jié)果顯示siKISS1R能夠逆轉(zhuǎn)PRMT7抑制前列腺癌細(xì)胞的體外侵襲能力(P<0.000 1),見(jiàn)圖4C。Western印跡法顯示,在PRMT7-L和PRMT7-P中,siKISS1R還逆轉(zhuǎn)了與前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá),MAP2表達(dá)下調(diào),S100A4表達(dá)上調(diào),見(jiàn)圖4D。PRMT7通過(guò)上調(diào)KISS1R的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲并且改變了前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白S100A4、MAP2的表達(dá)。

圖4 PRMT7調(diào)控下游蛋白KISS1R的表達(dá)Fig.4 PRMT7 regulates downstream protein KISS1R expressionA: 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低KISS1R對(duì)PRMT7-L和PRMT7-P遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;B: 細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低KISS1R對(duì)PRMT7-L和PRMT7-P遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;C: 細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低KISS1R對(duì)PRMT7-L和PRMT7-P侵襲的影響(n=3),****P<0.000 1;D: Western印跡法檢測(cè)KISS1R敲降后PRMT7-L和PRMT7-P中KISS1R、S100A4、MAP2的表達(dá)水平

3 討 論

前列腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的表觀遺傳學(xué)研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。有報(bào)道稱,Ⅰ型和Ⅱ型PRMTs的過(guò)表達(dá)參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘,本研究發(fā)現(xiàn)PRMT7表達(dá)與前列腺癌分期呈負(fù)相關(guān)[12]。前列腺是男性特有的器官;PRMT7在雄性生殖細(xì)胞中大量表達(dá),PRMT7敲除小鼠在胚胎發(fā)育過(guò)程中生殖細(xì)胞數(shù)量和睪丸大小顯著減少[13]。PRMT7在雄性生殖細(xì)胞系H19印跡基因甲基化過(guò)程中起關(guān)鍵作用[14]。因此,PRMT7是研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)有前景的上游靶點(diǎn)。本研究選取了雄激素依賴型和雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞,結(jié)果顯示,PRMT7在前列腺癌中與雄激素敏感無(wú)關(guān)。

KiSS-1轉(zhuǎn)移抑制受體(KISS1R),又稱G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54),最初被歸類為黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。在許多不同的癌癥中,KISS1/KISS1R系統(tǒng)發(fā)揮著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。在一項(xiàng)66例患者研究中,KISS1R高表達(dá)的結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移患者(67.9%)的5年生存率是KISS1R低表達(dá)患者(39.3%)的1.7倍。在另一項(xiàng)研究中,66例患者中較高的KISS1R表達(dá)與長(zhǎng)期總生存期呈正相關(guān)[15]。在子宮內(nèi)膜癌中,KISS1R已被確定為抑制轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)[16]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中,KISS1R的丟失容易導(dǎo)致淋巴轉(zhuǎn)移[17]。一項(xiàng)研究基于186例手術(shù)前列腺組織標(biāo)本,免疫組化顯示KISS1R在正常前列腺組織中表達(dá)較高[18]。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn),KISS1R在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌中的表達(dá)水平較低,且與臨床分期密切相關(guān)。在細(xì)胞水平上,高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3M的KISS1R表達(dá)低于PC3、DU-145和MDA-PC-2b[19]。KISS1R參與前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白S100A4、MAP2的表達(dá)變化調(diào)控前列腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的表型。S100A4是鈣結(jié)合蛋白,是S100蛋白家族的成員,參與細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的相互作用。它與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān),可在前列腺癌中發(fā)揮作用。在73例患者的組織中,S100A4的表達(dá)隨著惡性程度的增加而增加。在前列腺增生中,染色較弱或無(wú)染色是常見(jiàn)的,然而在癌癥中可觀察到強(qiáng)染色[20]。骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上可存在S100A4高表達(dá)[21]。在前列腺癌細(xì)胞中,S100A4敲低可以抑制PC3[22]和LNCAP-LA[23]的遷移和侵襲能力。在裸鼠皮下注射S100A4的siRNA,可通過(guò)減少腫瘤血管抑制腫瘤生長(zhǎng)[24]。前列腺根除手術(shù)后S100A4蛋白表達(dá)水平顯著降低,在良性前列腺增生男性血清中表達(dá)水平較低[25]。微管相關(guān)蛋白2是MAP家族成員之一,通過(guò)附著在微管上增加蛋白的穩(wěn)定性。Fisetin通過(guò)上調(diào)MAP2的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[26]。

綜上所述,PRMT7對(duì)前列腺癌的轉(zhuǎn)移具有保護(hù)作用。PRMT7在前列腺癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)。PRMT7通過(guò)上調(diào)KISS1R抑制體外前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)表明了PRMT7在前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的潛在重要作用。