鐵死亡在乳腺癌預后和靶向治療中的研究進展

鄭博文, 房 林

(1. 同濟大學醫學院,上海 200092; 2. 同濟大學附屬第十人民醫院甲狀腺乳腺外科,上海 200072)

最近的研究數據表明,乳腺癌超越肺癌成為世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤,其發生發展嚴重威脅了女性的生命健康[1]。放化療和靶向治療誘導的腫瘤細胞死亡成為了失去手術機會患者的主要治療手段,然而在一些臨床實驗中發現,腫瘤耐藥的發生時常導致了不良預后[2-3]。鐵死亡作為一種近幾年被發現的細胞死亡方式,不同于既往發現的細胞凋亡、細胞焦亡及壞死性細胞程序性死亡,鐵死亡發生時細胞的主要特征為鐵離子穩態破壞和脂質過氧化物(lipid reactive oxygen species, LipROS)累積。近些年,鐵死亡的不同機制逐漸被研究者發現,也出現了小分子的鐵死亡誘導劑,成為了耐藥腫瘤治療的新方向。

1 鐵死亡概述

1.1 鐵死亡的發現

2008年,Stockwell等[4]發現小分子化合物RSL3和RSL5可以誘導一種非凋亡的細胞死亡方式,且鐵離子螯合劑(DFO)和抗氧化劑(vitamin E)可以抑制這一過程,2012年他們將這一細胞死亡方式正式命名為鐵死亡(ferroptosis)[5]。

1.2 鐵死亡的特征

鐵死亡發生時,電鏡下細胞主要表現出線粒體嵴減少(消失);線粒體外膜破裂、皺縮;線粒體顏色深染;細胞膜破裂等現象,與細胞程序性死亡不同的是,細胞較少發生核損壞(如核膜破裂、核固縮)[6]。此外,發生鐵死亡的細胞表現出Fe2+、谷胱甘肽(gluta-thione, GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)和還原性輔酶NADPH的下調,Fe3+、LipROS和環加氧酶2的上調[7]。

1.3 鐵死亡的機制

正常細胞中,在氧化還原酶細胞色素P450的作用下,還原性輔酶NAD(P)H將電子傳遞給氧分子(O2)后生成過氧化氫(H2O2),H2O2與Fe2+發生芬頓反應生成Fe3+、氫氧根(OH-)和羥基自由基(OH·)。生成的羥基自由基在細胞內有較高的氧化活性,會導致脂質體膜上多不飽和脂肪酸長鏈雙鍵間的氫原子被剝奪進而形成LipROS,LipROS在多不飽和脂肪酸存在時易被轉運至細胞膜,當過多的LipROS被堆積在細胞膜而無法清除時,細胞膜發生不可以的破裂進而導致細胞死亡[8]。鐵離子在這一過程中發揮了催化作用,因此這一死亡方式被成為鐵死亡。然而,正常細胞有多套抗氧化系統,用于清除過量的LipROS,從而抑制鐵死亡,這些抗氧化系統也是多個癌癥相關信號通路調控的下游靶點,抗氧化系統的失衡是影響細胞鐵死亡進程的關鍵因素。我們將簡述現階段普遍認可的3個抗氧化系統,見圖1。

圖1 鐵死亡機制中的芬頓反應及3種抗氧化系統Fig.1 Fenton reaction and three antioxidant systems in the mechanism of ferroptosisGSH: 谷胱甘肽;CoQ: 泛醌;CoQH2: 泛醇;GSSG: 氧化型谷胱甘肽;ROS: 活性氧類;DHODH: 二氧乳清酸脫氫酶

1.3.1 System Xc-胱氨酸/谷氨酸轉運系統 System Xc-胱氨酸/谷氨酸轉運系統作為較早被發現的抗氧化系統,研究較為深入。System Xc-又稱胱氨酸谷氨酸反向轉運體(cystine/glutamate antiport),能夠以1∶1的比例將胱氨酸轉入胞內同時將谷氨酸轉出胞外,胱氨酸在胞質被分解為半胱氨酸,參與還原型GSH的合成[9]。GSH能幫助還原胞膜上的LipROS,其自身變為為氧化型谷胱甘肽[glutathione(oxidized), GSSG],谷胱甘肽過氧化物酶4(gluta-thion peroxidase 4, GPX4)通過促進NAD(P)H中的氫原子轉移促進GSH再生。在這套抗氧化系統中,System Xc-轉運蛋白的輕鏈亞基溶質載體家族7成員11蛋白被發現具有主要的轉運活性,其編碼基因轉錄也受多個癌基因和抑癌基因調控,如TP53、YAP/TAZ,成為研究者關注的重點[10]。GPX4作為關鍵酶加速GSH/GSSH循環,幫助及時清除過量的LipROS。研究發現,小分子化合物丁硫氨酸亞砜亞胺可以抑制GSH的合成,從而抑制GPX4活性,破壞抗氧化系統進而介導氧化損傷的細胞鐵死亡[11]。Stockwell等發現小分子化合物RSL3是通過直接共價結合并抑制GPX4促進了鐵死亡發生[12]。此外,由于GSH和GSSG含量檢測較為容易,GSH/GSSG值成為了判斷鐵死亡發生的一個重要指標。

1.3.2 胞質FSP1-CoQH2系統 鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1, FSP1)既往被命名為線粒體相關凋亡誘導因子2(apoptosis-inducing factor mitochondria-associated 2, AIFM2),是一種黃素蛋白,其編碼基因被認為是P53響應基因[13],但其真正作用機制長時間來未被發掘。Doll等[14]發現FSP1能介導一種區別于System Xc-系統的獨特的抗氧化防御系統,并將其正式命名。機制上,在胞質中,FSP1將NAD(P)H上的還原氫轉移到泛醌上,形成其還原形式泛醇[coenzyme Q10(reduced), CoQH2],泛醇能夠還原LipROS從而抑制鐵死亡的發生,這一過程是谷胱甘肽非依賴的。FSP1的抑制和GPX4的抑制能夠發揮很好的協同作用,促進鐵死亡的發生。進一步研究發現,FSP1的敲低和泛醌的缺陷均會導致細胞鐵死亡抑制的消失。

1.3.3 線粒體DHODH-CoQH2系統 由于發生在線粒體中的三羧酸循環伴隨了廣泛的電子傳遞和氧化磷酸化,線粒體成為細胞活性氧產生的主要場所,而鐵死亡的發生伴隨著LipROS的沉積,線粒體在鐵死亡過程發揮了重要作用。最近的研究中,Gan等[15]發現了線粒體內由二氫乳清酸脫氫酶(dihydr-oorotate dehydrogenase, DHODH)介導的抗氧化機制。DHODH的作用與FSP1類似,促進了泛醌的還原從而清除LipROS,只是其在線粒體內發揮作用。他們發現在GPX4低表達的腫瘤細胞中,鐵死亡水平上升并不顯著,作為代償,細胞內的DHODH含量顯著上升。此外,使用DHODH抑制劑(brequinar)能選擇性促進GPX4低表達腫瘤細胞的死亡。Gan等認為線粒體內DHODH和GPX4介導的抗氧化系統是平行關系的,可以發生互補,但線粒體抗氧化系統與胞質抗氧化系統則是互不干擾的[15]。

2 鐵死亡與乳腺癌的相關性

鐵死亡與多個腫瘤進展及耐藥相關,鐵死亡基因被發現是多個腫瘤信號通路的下游靶點,例如在耐藥性肝細胞癌中,Hippo信號通路中的關鍵蛋白YAP/TAZ入核后以TEAD和ATF4依賴的方式促進了SLC7A11的表達,從而克服了索拉非尼誘導的鐵死亡[16]。抑癌因子P53能通過抑制SLC7A11或者增加亞精/精胺n1-乙酰轉移酶1和谷氨酰胺酶2的表達來促進腫瘤細胞鐵死亡,有趣的是,P53也能直接抑制二肽基肽酶4活性或誘導細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A的表達來抑制鐵死亡發生[17]。我們綜述了鐵死亡和乳腺癌進展、預后預測、靶向治療的研究進展。

2.1 鐵死亡和乳腺癌進展

鐵死亡作為許多基因調控模式的下游共同環節,與乳腺癌進展關系密切。Chen等[18]的研究中發現筋素肌動蛋白捆綁蛋白1可以與SLC7A11相互作用,促進其發生泛素介導的蛋白酶體降解進而誘導乳腺癌細胞對他莫昔芬耐藥。Lin等[19]的研究發現上皮-間充質轉化介導的復發性乳腺腫瘤的盤狀結構域受體酪氨酸激酶2上調,在維持腫瘤細胞生長優勢的同時激活了YAP/TAZ介導的鐵死亡敏感,解釋了復發腫瘤細胞具有更高鐵死亡敏感性的原因。此外,在三陰性乳腺癌細胞系BT549中發現,?；o酶a合成酶長鏈亞型1能介導的α-桐木酸(αESA,一種代表性多不飽和酸)合成誘導BT549細胞發生鐵死亡,且這類鐵死亡不能被GPX4干擾所抑制[20],α-桐木酸合成抑制為GPX4抑制劑耐藥的乳腺癌治療提供了新的方向。

乳腺癌細胞鐵死亡也被許多非編碼RNA調控。環狀RNA circGFRA1可以競爭性結合miR-1228,調控靶基因FSP1的表達進而介導惡性腫瘤表型[21]。長鏈非編碼RNA PGM5P3-AS1通過與RNA結合蛋白NOP58結合穩定靶基因微管相關蛋白輕鏈C的表達,促進鐵死亡的發生進而抑制三陰性乳腺癌的惡性進展[22]。Yadav等[23]發現SLC7A11作為miR-5096的下游靶點,SLC7A11挽救能夠減少miR-5096介導的鐵死亡和促癌作用。還有許多其他非編碼RNA和乳腺癌鐵死亡相關性的研究,但是目前這方面研究主要聚焦于分子關系的闡述和非編碼RNA在預測鐵死亡發生和腫瘤預后的潛能,我們期待靶向鐵死亡相關非編碼RNA的小分子化合物合成,為乳腺癌治療提供更多方法。

腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)是一個復雜的整體,探究乳腺癌中腫瘤細胞和微環境內其他成分的相互作用是更為重要的,鐵死亡在其中也發揮了作用。Xie等[24]在脂肪細胞和乳腺癌細胞的共培養體系中發現了脂肪細胞對鐵死亡的保護作用,進一步的研究發現,脂肪細胞分泌的油酸可以在酰基輔酶a合成酶長鏈亞型3存在時抑制乳腺癌鐵死亡。Liu等[25]發現急性暴露在高27-羥基膽固醇下的乳腺癌細胞由于固醇調節元件結合蛋白信號干擾出現了脂質代謝紊亂,進而抑制了腫瘤細胞生長。而慢性暴露在高27-羥基膽固醇的乳腺癌細胞則表現出更高的致瘤和轉移能力,究其原因,這些細胞上調了GPX4軸活性并減少System Xc-抗氧化系統的依賴以適應脂質代謝異常的應激。這一研究也一定程度上解釋了肥胖和高膽固醇作為腫瘤不良預后因素的原因。有趣的是,研究者還發現TME中的細胞交互與鐵死亡相關,三陰性乳腺癌腫瘤細胞產生的白介素-6可以激活腫瘤相關巨噬細胞中JAK2/STAT3軸,誘導其分泌TGF-β1,又反向激活腫瘤細胞中的TGF-β1通路并調控肝白血病因子(HLF,一種新的癌蛋白)表達,HLF反轉錄激活γ-谷氨?；D移酶1抑制鐵死亡,促進乳腺癌生長和化療耐藥[26]。盡管上述研究發現了TME通過鐵死亡途徑對腫瘤進展的影響,但鐵死亡環節大都局限于腫瘤細胞內。腫瘤免疫逃逸作為腫瘤進展的重要因素和免疫治療的理論基礎,主要特征是腫瘤細胞誘導的效應T細胞耗竭,目前普遍認為這是程序性細胞死亡介導的,鐵死亡和免疫細胞耗竭關系的研究仍存在較大空白,盡管檢測上可能較為困難,但我們認為這對更好地認識TME是有意義的。

2.2 鐵死亡和乳腺癌預后預測

生物信息學的發展幫助研究者從腫瘤數據庫中挖掘鐵死亡相關基因,并構建預后預測模型完善乳腺癌預后評價體系。萬坤銘等[27]從TCGA數據庫中篩選出11個鐵死亡相關差異表達基因并構建乳腺癌預后預測模型,多因素COX回歸結果提示,該模型高風險評分是乳腺癌不良預后的獨立危險因子。也有分別針對Luminal型乳腺癌[28]和新輔助治療的乳腺癌[29]患者的類似研究。此外一項臨床研究中,Sha等[30]對紫杉醇-順鉑新輔助化療的乳腺癌患者穿刺樣本進行免疫組化檢測,探究已知鐵死亡相關基因ACSL4和GPX4作為病理完全緩解預測標志的潛能,發現ACSL4高表達、GPX4低表達及其聯合狀態是無病生存的獨立預后因素。鐵死亡和乳腺癌預后間有緊密聯系,許多差異表達基因被發現是鐵死亡環節中的關鍵基因并影響患者的臨床結局。但也有很多基因的功能仍未知,對他們進行更深入的分子機制研究能夠幫助研究者克服生物信息學預測準確性的限制,同時尋找更多乳腺癌藥物治療靶點。

2.3 鐵死亡和乳腺癌治療

2.3.1 小分子化合物誘導鐵死亡 研究發現表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼耐藥的三陰性乳腺癌細胞普遍存在GPX4表達升高[31],鐵死亡誘導劑(erastin)對耐藥細胞有很好的殺傷作用[5],然而鑒于erastin腎毒性仍未用于人體。FDA目前已經批準部分能誘導細胞鐵死亡的小分子化合物用于臨床腫瘤治療,同時也有許多藥物被開發出來。Ding和他的團隊[32]開創性地合成了DMOCPLT(天然菊內酯的衍生物)的前體化合物,通過促進GPX4的泛素化降解誘導鐵死亡,小鼠實驗沒有觀察到明顯的藥物毒性同時顯著延長了乳腺癌模型小鼠的生存時間。一些臨床常見藥物也與乳腺癌鐵死亡發生相關,例如Li等[33]發現氨氯酮通過靶向KAT5/GPX4軸抑制乳腺癌細胞增殖。此外,二甲雙胍通過誘導SLC7A11的UFMylation修飾促進乳腺癌細胞鐵死亡,且這一過程不被AMPK信號通路調控,揭示了二甲雙胍抗癌新機制[34]。中草藥人參中的活性成分紅參多糖被發現能夠抑制GPX4的表達,與鐵死亡誘導劑(erastin)聯用能發揮更好的抗乳腺癌生長作用[35]。目前開發或發現的小分子化合物主要靶向腫瘤細胞鐵死亡的經典System Xc抗氧化系統,針對其他非經典系統如FSP1-CoQH2以及TME中免疫細胞的死亡調控是未來藥物開發的方向。

2.3.2 針對鐵死亡的靶向遞藥 鐵死亡誘導劑的副作用是其應用的主要障礙,研究者試圖通過納米顆粒靶向給藥解決這一問題。Pan等[36]構建了鐵(Fe)-四(4-羧基苯基)卟啉的聚乙烯吡咯烷酮分散納米金屬有機框架,并被乳腺癌細胞膜包覆,形成納米顆粒和癌細胞膜的復合體。由于包裝了癌細胞膜,使復合體不易被免疫清除進而聚集于癌灶。隨后顆粒內的Fe3+通過芬頓反應促進GSH的耗竭和LipROS的累積誘發鐵死亡。Zhou等[37]構建了血紅蛋白、全氟碳、鐵死亡激動劑、聲敏劑verteporfin組成的紅細胞膜雜交偽裝的納米復合物,超聲刺激下SAFE大量供養并誘導乳腺癌細胞發生鐵死亡。體外實驗證明SAFE表現出腫瘤組織選擇性且在輕度超聲刺激下抑癌效果更好。此外,還有對pH敏感[37]和光敏感[38]的納米顆粒誘發鐵死亡的研究,這類納米顆粒設計的主要思路有以下四點: (1) 使用自體細胞膜包裝克服免疫清除;(2) 通過Fe3+和LipROS的被動累積和(或)抗氧化系統破壞誘發鐵死亡;(3) 聯合化療藥物發揮協同作用;(4) 設計外部啟動方式如超聲提高靶向性。

2.3.3 鐵死亡增加治療敏感性 放療和藥物耐受是乳腺癌治療效果不佳的主要原因。Zhang等[39]發現鐵飽和的MDA-MB-231細胞對放射治療更為敏感,機制上除了鐵死亡外,鐵飽和細胞下調HIF-1α表達,改善腫瘤缺氧微環境,促進輻射誘導的缺氧DNA損傷,他們的研究為放療聯合鐵負荷治療提供依據。對于化療耐藥細胞,聯合鐵死亡激動劑發揮了效果[5],今后的方向是提升臨床應用安全性。此外Zou等[40]發現曲妥珠單抗治療耐藥相關基因FGFR4,通過FGFR4-βcatenin/TCF4-SLC7A11軸抑制鐵死亡并促進HER2陽性乳腺癌耐藥,聯合鐵死亡激動劑同樣發揮了顯著治療效果。以上研究均提示激活鐵死亡和傳統治療方法的聯合應用能發揮協同作用。

3 總 結

鐵死亡作為近年來被發現的新的細胞死亡方式,在乳腺癌治療中發揮重要作用。與其他細胞死亡方式不同,鐵死亡發生時有獨特的細胞特征。越來越多研究發現鐵死亡與乳腺癌的發展及預后有密切關系。隨著鐵死亡的機制被不斷發現,更多針對鐵死亡機制的藥物及治療手段被開發并用于乳腺癌治療。今后鐵死亡藥物開發的方向是TME的整體調控以及對非經典抗氧化系統的發掘,期待副作用更小且靶向性更強治療手段。