電針聯合推拿對大鼠卒中后認知功能障礙的恢復作用及海馬小膠質細胞的參與機制

李子康， 余小江， 萬婷， 羅貴聰， 張蕊， 張靜

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

卒中后認知功能障礙被定義為多個認知領域（如學習、記憶和執行功能）的衰退，這可能長期影響三分之一的中風幸存者[1-2]。聯合療法的概念對于治療復雜卒中具有重要的指導意義，電針聯合推拿因其操作簡單易行、副作用少而被廣泛應用于臨床。本課題組前期臨床應用電針聯合推拿治療卒中后認知功能障礙患者，取得了良好的療效，但其作用機制尚不明確。小膠質細胞在大腦中大量存在，約占總神經膠質細胞的20%[3]。研究[3]表明，小膠質細胞是中樞神經系統的主要常駐免疫細胞，廣泛分布于中樞神經系統（CNS）中并參與微環境的調控。小膠質細胞參與幾乎所有的腦部疾病，包括神經退行性疾病、創傷性腦損傷和精神疾病等，活化后的小膠質細胞可分泌促炎和抗炎介質，在中樞神經系統損傷過程中發揮重要的作用[4]。因此，本研究建立大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠模型，觀察電針聯合推拿對大鼠卒中后認知功能障礙的治療作用及對海馬小膠質細胞的影響，以期為臨床治療卒中提供更多的理論基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體（SPF）級成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量250 ～300 g，購自湖北省實驗動物研究中心（中國武漢），生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。所有動物實驗均按照國家衛生研究院和廣州中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會發布的《實驗動物的護理和使用指南》進行。本研究方案已經廣州中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審批，動物倫理批號：AEWC-2001461。

1.2 試劑與儀器戊巴比妥鈉（美國Merck Millipore公司）；TRIzol試劑、PrimeScript逆轉錄酶MASTER MIX 試劑盒（日本TaKaRa 公司）。單絲尼龍縫線（L3600，廣州嘉陵有限公司）；電針裝置（KWD-808 Ⅱ，常州英迪電子醫療器械有限公司）。

1.3 模型建立與分組用1%戊巴比妥鈉（200 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，根據Longa等[5]研究構建MCAO模型。具體操作步驟如下：暴露左側頸總動脈、頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）并小心隔離。在遠端結扎ECA 后，在ECA 上開一個小切口，將單絲尼龍縫線從ECA切口處插入ICA，直到感覺到輕微的阻力。在2 h 的缺血期后，緩慢移除單絲尼龍縫線以恢復大腦中動脈（MCA）區域的血液供應，實現再灌注。假手術組大鼠給予相同的手術，但不插入單絲尼龍縫線。若觀察到大鼠未能伸出右前爪，向右盤旋，甚或向右跌倒則判斷造模成功[5]。

分組如下：假手術組、模型組、治療組，每組6只。假手術組，作為空白對照；模型組大鼠構建MCAO 模型；治療組大鼠構建MCAO 模型后，給予電針聯合推拿治療。

1.4 電針聯合推拿干預電針與推拿在一天的同一時間（大約上午9∶00）先后進行。大鼠被固定在固定裝置（在針刺干預前至少3 d，使大鼠適應制動裝置）中。采用0.25 mm × 13 mm 一次性無菌不銹鋼針插入百會（GV20）和足三里（ST36）[6]。根據華興邦等發表的“大鼠穴位圖譜的研制”[7]確定穴位操作的準確位置。GV20 位于頭頂，正中矢狀線與兩耳尖連線的交點處。ST36 位于膝關節下腓骨頭遠端5 mm 處，脛骨結節外側2 mm 處。將兩個電極附著在電針治療組大鼠的頭部，使用電針裝置對大鼠進行刺激，疏密波頻率為2/15 Hz。選擇頭頂部百會、神庭（GV24，大鼠頭前正中線，額頂骨縫交界線前方），腿部足三里，點按法操作每次10 min。術后第1 天開始電針聯合推拿治療，每日1次，連續7 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 神經學評分 所有行為學檢測均在白天進行，且提前3 d 進行適應性訓練，避免大鼠產生焦慮和恐慌，影響實驗結果。

（1）滾軸試驗（rotard test）：將大鼠首先放置在以4 r/s轉動的滾軸上，然后以加速度為0.3 r/s逐漸調整滾軸轉速并開始計時，當大鼠掉落滾軸時停止計時，將大鼠從開始加速至掉落滾軸的時間進行記錄。每隔1min 檢測1 次，共檢測5 次，取平均值作為最終試驗結果。

（2）網格試驗（grid test）：將大鼠首先置于水平金屬網格（12 cm × 12 cm，格間距為1 cm）上，待大鼠四腳爪均抓住金屬網格后，180°翻轉金屬網格裝置并開始計時，當大鼠四腳爪均掉落網格時停止計時，懸掛時間超過180 s時僅計為180 s。每隔1 min檢測1次。共檢測5次，取其平均值作為最終試驗結果。

1.5.2 莫里斯水迷宮試驗 將大鼠置于EthoVision XT Morris 水迷宮視頻跟蹤測試系統中，該系統可以自動記錄大鼠找到平臺的時間。該程序如前所述[8]進行。在干預的第40 天，開始為期5 d 的隱藏平臺試驗。訓練時間為60 s，所有動物每天訓練2 次。找到平臺的時間被記錄為逃避潛伏期。大鼠需要人工引導在平臺上停留10 s，如果大鼠前5 d沒有找到平臺，則記錄逃避潛伏期為60 s。在第六天，移除平臺以測試大鼠的空間搜索能力，隨后記錄大鼠通過平臺最初放置處的頻率[9]，計算停留在目標象限的時間百分比和在60 s內首次到達平臺區的時間。

1.5.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法觀察腦梗死面積 使用戊巴比妥鈉（800 mg/kg）給予大鼠安樂死，經心臟灌注生理鹽水。迅速取出腦，從口側至尾側冠狀切片，37 ℃避光，采用1%的TTC染色15 min。根據白色梗死區和紅紫色非梗死區區分腦組織。按照公式[10]計算：腦梗死面積=[對側半球面積-（同側半球面積-梗死面積）/對側半球面積]×100%。

1.5.4 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測腦組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CD206、Arg-1、IL-10 mRNA 表達 按照說明書指示，用TRIzol 試劑從各組大鼠腦組織中提取總RNA。用PrimeScript逆轉錄酶MASTER MIX 試劑盒獲得cDNA。PCR 反應條件：94 ℃預變性35 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環。引物擴增長度為100 ～200 bp。用2-ΔΔCT方法[11]進行目的基因定量，以GAPDH 做內參。引物序列如下：IL-1β 上游引物為5’- TCCA GGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游引物為5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’；TNF-α 上游引物為5’-TGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’，下游引物為5’-GGAGGCCATTTGGGAACT-3’；IFN-γ上游引物為5’-TGAACGCTACACACTGCATCTTG G-3’，下游引物為5’-CGACTCCTTTTCCGCTTCC TGAG-3’；CD206 上游引物為5’-CTTCGGGCCTT TGGAATAAT-3’，下游引物為5’-TAGAAGAGCC CTTGGGTTGA-3’；Arg-1 上游引物為5’- CTTGG CTTGCTTCGGAACTC-3’，下游引物為5’-GGAG AAGGCGTTTGCTTAGTTC-3’；IL-10 上游引物為5’-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3’，下游引物為5’-ACCTGCTCCACTGCCTTGCT-3’；GAPDH 上游引物為5’-AT GACCACAGTCCATGCCATC-3’，下游引物為5’-GAGCTTCCCGTTCAGCTCTG-3’。

1.6 統計方法采用SPSS 22.0 統計學軟件（USA）和Graph prism 8.0軟件對數據進行分析和作圖，計量資料以均數±標準差（±s）表示，首先進行正態性和方差齊性檢驗，檢驗符合正態分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），事后檢驗采用Tukey’s多重比較法。P為雙側檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針聯合推拿改善MCAO 模型大鼠腦梗死面積及神經功能為探究電針聯合推拿是否能夠減輕卒中大鼠腦損傷及恢復神經功能，本研究進行了滾軸試驗和網格試驗觀察其行為學表現，采用TTC染色觀察腦梗死面積。結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠滾軸和網格停留時間縮短（均P＜0.01），腦梗死面積增大；與模型組比較，治療組大鼠滾軸和網格停留時間延長（均P＜0.01），腦梗死面積減小。見圖1。上述結果表明，電針聯合推拿可有效改善卒中大鼠腦梗死面積及神經功能。

圖1 各組大鼠神經學評分、腦梗死面積比較Figure 1 Comparison of neurological scores and cerebral infarct size among various groups of rats

2.2 電針聯合推拿改善MCAO 大鼠認知功能障礙為探究電針聯合推拿是否可以改善MCAO大鼠的認知功能障礙，本研究進行了莫里斯水迷宮試驗，結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數降低，第1次達到平臺的時間增加，停留在目標象限的時間比降低（均P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數升高，第1次達到平臺的時間減少，停留在目標象限的時間比升高（均P＜0.01）。見圖2。上述結果表明，電針聯合推拿可有效改善MCAO 大鼠的認知功能障礙。2.3 電針聯合推拿促進MCAO 大鼠海馬小膠質細胞M2 極化為了探究電針聯合推拿是否對MCAO大鼠海馬小膠質細胞產生了影響，本研究通過qRT-PCR 法檢測了各組大鼠小膠質細胞中M1、M2 極化標志物的mRNA 表達變化，結果顯示：模型組大鼠海馬小膠質細胞M1 極化標志物（IL-1β、TNF-α、IFN-γ）表達較假手術組升高（均P＜0.01），而M2 極化標志物（CD206、Arg-1、IL-10）表達較假手術組降低（均P＜0.01）；治療組大鼠海馬小膠質細胞M1 極化標志物表達較模型組降低（均P＜0.01），而M2 極化標志物表達較模型組升高（均P＜0.01）。見圖3。以上結果表明，電針聯合推拿可促進MCAO 大鼠海馬小膠質細胞從M1 極化向M2極化發展。

圖2 各組大鼠認知功能比較（莫里斯水迷宮試驗）Figure 2 Comparison of cognitive function among various groups of rats（Morris water maze test）

圖3 各組大鼠小膠質細胞M1、M2極化標志物mRNA表達比較Figure 3 Comparison of mRNA expressions of M1 and M2 polarization markers in microglial cells among various groups of rats

3 討論

卒中后認知功能障礙歸屬于中醫學“善忘”“呆癡”“神呆”“愚癡”“呆病”等范疇，病位主要在腦，臟腑虛衰以致痰瘀內生、痹阻腦竅是本病發生、發展的共性機制，開竅醒神、健脾通絡為主要治法。百會和足三里是中醫臨床治療中風最常用的穴位。百會屬于督脈，具有清頭散風、開竅醒神之功效。足三里屬于胃經，具有健脾和胃、益氣補虛、通絡除痹的功效。兩穴同用具有補中益氣、安神定志、調節陰陽之效，研究表明，電針百會、足三里穴可以通過多種途徑和環節減輕中風后炎癥損傷，減少腦梗死體積，促進神經功能恢復[12-16]。而推拿可以改善組織灌注、信號轉導、細胞應激和炎癥[17-18]，有助于機械刺激后運動/神經肌肉系統重塑[19-20]。神庭穴屬于督脈，具有清頭散風、鎮靜安神之功效，主治頭痛、眩暈、癲狂癇、失眠、健忘等證。本研究應用電針百會穴、足三里穴聯合點按百會、神庭、足三里穴治療MCAO 模型大鼠，神經學評分結果表明，MCAO模型大鼠的運動和感覺協調性降低，而電針聯合推拿可在一定程度上改善這種情況。本研究進一步通過TTC 染色法觀察了MCAO 大鼠大腦梗死情況，其結果與神經學評分結果相一致，MCAO模型大鼠腦梗死面積顯著增加，而電針聯合推拿可減輕大鼠腦梗死，表明MCAO 大鼠接受電針聯合推拿治療后，運動協調性、認知功能及腦梗死情況均得到顯著改善。

小膠質細胞是具有高度可塑性的細胞，對改變其環境的刺激反應多樣[21-22]。小膠質細胞的激活被定義為經典激活（M1）和選擇性激活（M2）表型[23]，M1 小膠質細胞可釋放促炎細胞因子破壞神經元，相反，M2 小膠質細胞可分泌神經保護介質和營養因子[24]。有研究揭示了缺血性卒中后梗死周圍區域存在M2-M1 小膠質細胞表型的轉變[25]。這種小膠質細胞表型轉化亦在脊髓損傷模型中報道[26]。提示小膠質細胞的表型改變可能是多種中樞神經系統損傷的共同病理機制。小膠質細胞的M1/M2極化主要通過M1（例如IL-1β、TNF-α、IFN-γ）和M2（例如CD206、IGF-1、TGF-β、Arg-1、IL-10）相關基因的表達來分類[27-29]。M2 小膠質細胞可吞噬受損的神經細胞碎片，抑制過度的炎癥反應，促進組織修復和神經元再生，防止繼發性炎癥損傷，并維持正常的中樞神經系統微環境[30]。維持小膠質細胞的M2 表型，同時抑制M1 小膠質細胞的極化，對于減輕缺血性卒中后腦損傷具有很大的潛力。Lu 等[31]通過觀察小鼠大腦內小膠質細胞M1、M2 極化標志物發現，米諾環素促進動脈閉塞-再灌注（MCAO/R）小鼠小膠質細胞M2極化，抑制M1 極化，可使神經元存活和神經功能恢復。本研究結果顯示，MCAO大鼠接受電針聯合推拿治療后，腦組織M1極化標志物IL-1β、TNF-α、IFN-γ mRNA 表達顯著減弱，M2 極化標志物CD206、Arg-1、IL-10 mRNA 表達顯著增強，提示MCAO大鼠海馬小膠質細胞的極性由M1 轉變到了M2，表明聯合治療在一定程度上促進了MCAO 大鼠腦組織抗炎反應。

綜上所述，電針聯合推拿可通過介導小膠質細胞M2 極化改善大鼠卒中后認知功能障礙，但調控小膠質細胞極化過程復雜，具體的分子調控機制有待進一步深入研究。