夏季珠江口沖淡水對氨氧化古菌的空間演替及分布規律的影響

荊紅梅,周鵬,張玥,劉皓,劉紅斌

(1.中國科學院 深海科學與工程研究所,海南 三亞 572000;2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(珠海),廣東 珠海 519082;3.中國科學院三亞海洋科學綜合實驗室,海南 三亞 572000;4.香港科技大學 海洋科學系,香港 999077)

研究者主要采用16S rRNA基因分析方法進行不同環境樣品中AOA的豐度以及系統發育分析[4].但該基因過于保守,甚至不同群落的16S rRNA基因相似性能達97%以上,所以很難將AOA的不同種屬在16S rRNA基因水平上區分開來[5].隨著分子生物學技術的發展以及對AOA的深入研究,發現了氨氧化過程中的關鍵酶—氨單加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO).該酶是由amoA、amoB、amoC基因分別編碼的α、β、γ 3個亞基組成的三聚體膜結合蛋白,屬于單加氧蛋白家族[6].相比較16S rRNA基因作為分子標記,編碼α亞基的amoA基因具有較強的保守性和明顯的專一性,在相近的群落之間具有高分辨率,并且具有功能基因特性,因而在氨氧化古菌的遺傳多樣性分析方面具有優勢,常被作為研究AOA的分子標記[7].

目前利用AOA功能基因amoA和qPCR技術來研究不同生境中AOA的基因豐度分布特征的報道較多,包括中國內蒙古草地、東北的海河、珠江口到南海的沉積物、日本海、北太平洋加利福尼亞海灣和蒙特利海灣等.不同水體環境中的AOAamoA基因豐度也不同.通常海水樣品中的AOAamoA基因拷貝數介于103～108copies/L之間;且表層海水的豐度普遍低于透光層區域;不同營養類型湖泊中基因拷貝數為7.80×104～1.34×106copies/L[8],珠江底泥中的拷貝數為9.60×109～5.10×1010copies/kg[3].

珠江年徑流量約3 492億m3,僅次于長江,是黃河年徑流量的6倍.全長2 320 km,流域面積約44萬km2,且4至9月的徑流量占全年的80%.珠江口是三角洲網河和殘留河口灣并存的河口,徑流大,潮差小,含沙量相對較小.河口區河汊發育,水網密布[3].此外,珠江口夏季受沖淡水影響明顯,流速大.目前對于珠江口AOA的研究表明其在水體中的豐度通常高于氨氧化細菌[9],以Shallow group簇和SCM1-like簇樣亞系為優勢類群,且在DNA水平上的整體類群組成與cDNA水平上活躍參與氨氧化過程的類群具有明顯差異[10].同時AOA在較大的顆粒有機物上表現出更高的轉錄活性[11].為了深入了解夏季珠江口沖淡水對功能微生物類群的影響,利用新一代高通量測序技術和熒光定量PCR(qPCR)技術研究了夏季珠江口不同鹽度、不同深度及不同過濾孔徑(0.22 μm 代表自由生活的;3 μm代表附著的)的各水體樣品中的AOA群落結構組成以及豐度分布特征.此外,在DNA和cDNA水平上進行了比較研究,解析了關鍵的生態因子,系統闡述徑流輸入對AOA的群落演替的影響.

1 材料和方法

1.1 樣品采集

珠江口夏季海水樣品借助廈門大學航次于2014年7月9日至26日采集.共包括9個站位(圖1):A02、A04、A06、A08、A10、A12、A14、A16、A18.每個站位的表層及底層海水經3 μm和0.22 μm的聚碳酸酯濾膜來分級過濾,以收集附著生活(3 μm,attached)的和自由生活(0.22 μm,free-living)的微生物類群.濾膜放入加有500 μL RNAlater的凍存管中并立即凍入液氮罐中,回到實驗室后保存于-80 ℃超低溫冰箱中.

1.2 核酸提取,PCR擴增與測序

濾膜上的DNA采用Genomic DNA Mini Kit試劑盒提取,RNA采用PureLinkTM RNA Mini Kit試劑盒提取,然后第一鏈cDNA采用SuperScript?Ⅲ First-Strand試劑盒合成.利用含MID的特異性引物對amoAF和amoAR擴增AOAamoA基因序列[12].用無菌水作為反應的陰性對照.DNA使用1 μL為模板,cDNA使用3 μL為模板;每個PCR的反應體系總體積為20 μL.PCR反應程序為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性45 s,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,運行35個循環;最后72 ℃延伸7 min,保存在4 ℃.PCR產物用質量分數1.2%的瓊脂糖凝膠進行檢測,以100 bp Ladder為DNA標準Marker.PCR產物經純化后,使用Roche GS Junior測序平臺進行高通量測序.

1.3 實時熒光定量PCR

AOAamoA基因的定量PCR反應采用amo196F和amo277R[8]為引物,利用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒,在ABI 7500 Fast定量PCR儀上進行.每個qPCR的反應體系為10 μL,其中1 μL DNA或cDNA為模板,并使用無菌水作為陰性對照,每個樣品和質粒均做3個平行.實時定量PCR反應程序為:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃延伸1 min,45個循環;然后進行溶解曲線檢測階段,熒光取值在60 ℃和溶解曲線全程.利用梯度稀釋的質粒(10-8～10-1)分別作為模板進行qPCR,并用其分別對應的Ct值和基因拷貝數來構建標準曲線(R2=0.990 6,擴增效率為102.16%),然后將樣品(DNA、cDNA)通過qPCR獲得的Ct值分別代入標準曲線中進行計算,最后用SigmaPlot對數據進行繪圖.

1.4 生物信息學分析

通過Roche GS Junior平臺所獲得的AOAamoA基因原始序列利用mothur軟件(http://www.mothur.org/)進行初步篩選和去雜,將引物以及測序標簽的錯配堿基數大于1的序列去除,同時將總序列長度小于300 bp的序列去除,隨后去除含有嵌合體的序列,最終形成一個shared文件.利用mothur的get.oturep命令基于97%的序列相似度得到各個OTU的代表序列名.隨后,按照樣品最低序列為標準對數據進行均一化處理.利用Primer 5進行多樣性指數分析,主要包括群落豐富度指數(Margalef)、均勻度指數、香農指數、辛普森指數等,其計算公式分別為:d[Species Richness(Margalef)]=(S-1)/ln(N),J'(Pielou's Evenness)=H'/ln(S)、H'(Shannon)=-∑i[Pi×ln(Pi)],1-λ'(Simpson)=1-∑i[Ni×(Ni-1)/N×(N-1)],其中S為群落總OTU數,N為總序列數,Pi為第i個OTU在整個序列中所占的比例,Ni為第i個OTU的個體數.各站位序列覆蓋度(Coverage,C)是利用mothur軟件的summary.single命令基于97%的序列相似度對氨氧化古菌amoA基因序列進行計算的,其計算公式為C=[1-(n1/N)],其中n1為序列中僅有一條序列的OTU數,N為序列的總OTU數.

利用mothur軟件進行樣品間相似度的聚類分析,其中非度量多維尺度分析(NMDs)利用Primer 5[13]完成.此外,還利用mothur的tree.shared命令基于布雷柯蒂斯(Bray-Curtis)距離進行樣品間的非加權組平均法(UPGMA)聚類分析.

挑選豐度較高的OTUs(總序列數大于20)進行系統發育分析.先將這些OTUs的代表序列上傳到NCBI的GenBank數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)做blastn比對,并下載參考序列.基于ClastalW進行序列比較,并切除兩端不匹配的序列,然后利用Mega 6[14]的Models進行模型預測.挑選出最優的模型General Time Reversible,利用最大似然法(Maximum Likelihood)進行Bootstrap值為1 000的系統發育樹構建.

1.5 統計學分析

利用CANOCO V5.0對氨氧化古菌的群落結構組成和環境因子之間進行冗余分析(RDA);并利用SPSS 20對amoA基因豐度和主要類群與環境因子之間分別進行兩兩之間的Spearman相關性分析,以確定達到極顯著水平(p<0.01)或顯著水平(p<0.05)的環境生態因子.

1.6 基因序列的提交號

將獲得的原始序列提交至NCBI數據庫,獲得序列號PRJNA948716.

2 結果與討論

2.1 氨氧化古菌群落多樣性

夏季珠江口的表層及底層的溫鹽差異非常明顯(圖1).從珠江河口A2一直到外海A18的斷面的鹽度差異尤其明顯,包括了全淡水環境到淡海水交匯環境最后到全海水環境(圖1).

每個站位的樣品序列的覆蓋度均達到了0.99(表1),且稀釋曲線隨測序量增加而逐步達到飽和,均顯示了測序深度足夠反映樣品的多樣性.

表1 夏季珠江口氨氧化古菌amoA基因測序信息

總體而言,夏季珠江口各站位AOA的OTUs偏低,數目最多的A2B-0.22擁有52個OTUs,而A18B-3僅含有6個OTUs(表1).其次,底層樣品的OTUs數目高于表層;cDNA樣品的OTUs數目高于DNA,結果與之前的研究相似[10].主要是淡水來源的A2B站位含有最大的OTU數(52),同時也有最大的群落豐富度指數(6.34)、均勻度指數(0.56)、香農指數(2.22)和辛普森指數(0.81)(表1).生物群落的多樣性反映了生物群落的豐富度以及各個類群的相對比例.群落豐富度指數(Margalef)越高,說明此環境中生物群落的種類越豐富;對于均勻度指數J'(Pielou's Evenness)來說,指數越高說明在此環境中各群落的分布均一性越好;辛普森指數代表了群落優勢度,其值越高說明群落在此環境種類越豐富;香農指數則是綜合考慮了群落豐富度和均勻度的一個群落多樣性指數,其指數值越高,則反映在此環境中群落多樣性越高.基于各個參數,大概得出以下結論:(1)鹽度較低的站位(例如A2、A4、A6和A8),AOA的群落多樣性顯著高于其他鹽度較高的站位(p<0.05);(2)同一研究站位,表層來源的AOA群落多樣性高于底層;(3)通過DNA水平和cDNA水平的比較,發現cDNA水平上的群落多樣性反而高于DNA水平;(4)cDNA水平的均勻度指數高于DNA水平,說明AOA的一些豐度較低的物種卻具有極強的轉錄活性或者一些豐度較高的物種具有極低的轉錄活性,如豐度最高的OTU1在DNA水平上的相對比例為68%～97%,cDNA水平上為48%～60%;而OTU2在DNA水平上的相對比例為2%～27%,cDNA水平上為25～45%.cDNA水平上更為直觀地反映了活躍代謝的微生物類群,能增加人們對于微生物群落組成和分布及生態功能的全面認識,如之前在珠江口的研究發現某些SCM1-like簇亞系的高轉錄活性[10].此外,轉錄水平上的結果還需要結合其他研究手段來反映真正的生態功能.

2.2 AOA amoA基因的系統發育分析

夏季珠江口的AOA主要聚于7簇,分別是Shallow group簇,Freshwater簇,SCM1-like簇,Coastal簇,Sediment簇,Deep group簇,Soil簇,其中Shallow group簇被細分為Shallow group Ⅰ亞簇、Shallow group Ⅱ亞簇,Shallow group Ⅲ亞簇;Freshwater簇和Coastal簇是本研究中新發現的并分別命名(圖2).

Shallow group簇是夏季珠江口的優勢種群,這與之前的研究相一致[10].其中Shallow group Ⅰ亞簇包括OTU1和OTU3在內共7個OTUs;Shallow group Ⅱ亞簇也包含了8個OTUs;Freshwater簇,SCM1-like簇,Coastal簇,Sediment簇,Deep group簇,Soil簇分別包含8,3,6,4,2,2個OTUs.這些序列絕大多數來源于海洋水體,少部分序列來自海洋沉積物和陸地生態系統.其中Shallow group Ⅰ亞簇的同源序列來源于中國東海水體和南海水體、沉積物[15];Shallow group Ⅱ亞簇的同源序列來源于揚子江河口[16]、東北太平洋的缺氧區[12]、東海水體和南海水體及沉積物[15],同時CN25菌株[17]也聚集在這個亞簇;Freshwater簇的同源序列來源于東江水體[18]及淡水水族館[19];Coastal簇的同源序列包括2株海岸分離的純菌(PS0和HCA1)[2]和來自墨西哥海灣、南海表面沉積物[16]的環境樣品序列;Sediment簇的同源序列來源于夏威夷珊瑚礁保護區沉積物、加利福尼亞灣沉積物[12];Deep group簇的同源序列來源于東北太平洋缺氧區、加利福利亞灣沉積物[9]和東海水體[15];Soil簇的同源序列來源于崇明島東灘濕地[20]、太湖沉積物[21]和東海水體[15].

2.3 氨氧化古菌群落結構組成

通過對得到的總計185個OTUs進行分類鑒定,獲得珠江口夏季AOA的群落結構組成信息(圖3).

除A2B-0.22樣品外,其他樣品都被Shallow group Ⅰ亞簇主導,而A2B-0.22樣品的AOA來源主要是Freshwater簇,其中底層樣品來源的OTU1和表層樣品來源的OTU3分別在其對應的群落結構組成中占據著較大比例,而OTU1和OTU3在系統進化樹上均屬于Shallow group Ⅰ亞簇.在Tara Oceans的研究中,Shallow group Ⅰ亞簇在全球海洋的表層AOA群落中占主要地位[22],這表明Shallow group Ⅰ亞簇更適合此水域的環境,正如其代表性培養種(CandidatusNitrosopelagicusbrevisCN25)的基因組和蛋白質組學所揭示的結果,Shallow group Ⅰ亞簇具有高編碼密度和普遍分布于寡營養表層海洋的流線型基因組[23].通過對同一站位樣品DNA和cDNA水平上進行比較,Shallow group Ⅱ亞簇在cDNA水平上擁有相對更高的比例;Deep group簇只在cA16B-0.22和cA18B-0.22兩個樣品中存在;且Soil簇來源的也主要在A2B-0.22樣品中發現.本研究的群落結構組成與南海海域100 m[15]的AOA群落結構組成極為相似,但本研究中未發現Shallow group Ⅲ亞簇.這可能是由于本研究的采樣點集中在珠江口,而Shallow group Ⅲ亞簇主要在南海開放海域中發現所造成的.

2.4 氨氧化古菌群落聚類分析

通過NMDs和UPGMA兩種聚類分析,樣品間的相似性聚類表現出了幾乎一致的結果(圖4):除淡水來源A2B站位和鹽度相對較低的A8B站位外,所有底層海水來源的0.22 μm(free-living)樣品聚集在一起;表層海水來源的free-living樣品聚集在一起;而底層海水來源的3 μm(attached)樣品聚集在一起,說明表層和底層來源的AOA差異較明顯.自由生活的與附著的AOA群落之間也存在著一定的差異,但相對于表層和底層之間的差異較小.

2.5 氨氧化古菌的amoA豐度分布

利用標準曲線分別計算自由生長和附著生長的AOAamoA基因拷貝數(圖5).自由生活(0.22 μm)的AOAamoA在DNA水平上表層拷貝數為2.31×102～2.76×105copies/L,其中A2、A8、A16站位未檢出;底層AOAamoA基因拷貝數為3.40×103～1.81×106copies/L;而底層cDNA水平上AOAamoA基因拷貝數為4.66×101～1.73×104copies/L且A2和A6站位未檢出.附著生活(3 μm)的AOAamoA在DNA水平上表層拷貝數為8.57×101～1.98×104copies/L,其中A8站位未檢出;表層cDNA水平上AOAamoA基因拷貝數為1.93×102～5.87×103copies/L且A2、A8、A16和A18站位未檢出;底層AOAamoA基因拷貝數為2.21×102～6.60×103copies/L;而底層cDNA水平上AOAamoA基因拷貝數為1.06×102～5.81×103copies/L.通過以往的文獻報道顯示:珠江表層水體中AOAamoA拷貝數為 6.27×104～3.63×107copies/L,而底層水體為3.59×105～4.98×108copies/L[10];不同營養類型湖泊中AOAamoA基因拷貝數為7.80×104～1.34×106copies/L[8].總體而言,0.22 μm比3 μm有著更高的amoA基因豐度;無論是在0.22 μm孔徑還是在3 μm孔徑上,amoA的豐度都有著從河口到外海升高的趨勢;而從DNA相對于cDNA上的占比看,0.22 μm孔徑上的比值大于3 μm孔徑,說明自由生活的AOAamoA基因活性比附著生活的低,表明了AOA微生物的生活策略與之前的研究相符[10].在0.22 μm孔徑上,底層的樣品的amoA基因豐度遠遠大于表層.

2.6 相關性分析

RDA分析表明夏季珠江口氨氧化古菌群落組成受到溫度和鹽度顯著影響.Spearman相關性分析顯示,溫度與鹽度及Shallow group Ⅱ亞簇呈極顯著負相關(p<0.01);鹽度與Shallow group Ⅱ亞簇呈極顯著正相關(p<0.01),而與SCM1-like簇呈負相關(p<0.05);但溫度和鹽度均未與amoA基因豐度顯示出任何相關性(表2).以往對珠江口河口到南海沉積物中氨氧化微生物的研究也證明了鹽度是影響AOA群落結構的關鍵因素,且AOA的豐度與pH和溫度呈正相關[3];珠江口沉積物中的AOA豐度與鹽度相關,且鹽度越低豐度更高[24].而本研究發現AOAamoA基因豐度隨著鹽度降低而降低,這可能是本研究聚焦于海水樣品所造成的差異,且河口系統中AOA的amoA基因豐度不僅僅受鹽度因子的調節,同時還會受到溫度、無機營養鹽濃度和溶解氧的組合控制[11].

表2 夏季珠江口氨氧化古菌群落組成、豐度與環境因子之間的Spearman相關性分析

3 結 論

通過對夏季珠江口氨氧化古菌的群落結構及豐度分布進行研究,研究結論如下:(1)主要是淡水來源的A2站位有著最大的AOA群落多樣性但有最低的amoA豐度,且群落結構組成主要是Freshwater簇占主導;(2)除A2站位外,其他樣品均被Shallow group Ⅰ亞簇主導,而Shallow group Ⅱ亞簇有著更高的轉錄活性;(3)AOAamoA基因豐度在底層樣品中明顯高于表層,且free-living的AOA豐度比attached高10～1 000倍;(4)Shallow group Ⅱ亞簇與溫度存在極顯著負相關,但其和SCM1-like簇與鹽度存在著顯著正相關.