基于生物信息學分析腎透明細胞癌中植物同源結構域指蛋白6的表達及臨床意義△

于建宇，方愛鐘，鄭義，于春娜，彭怡琛，林藝，汪曉敏#，李文斌,#

1首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經腫瘤綜合治療病區，北京 100071

2首都醫科大學健康醫療大數據國家研究院，北京 100069

腎細胞癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中最常見的亞型是腎透明細胞癌（renal clear cell carcinoma，KIRC），占所有腎細胞癌類型的70%～80%[1-2]，是一種惡性程度相對較低、發展緩慢的腫瘤。手術是KIRC 的主要治療手段，但大多數情況下，即使進行了早期手術治療，仍有30%轉移的可能[3-6]。KIRC 已被證明與免疫微環境[7]、廣泛的腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學改變有關[8]，這些改變可導致許多腫瘤相關基因表達水平的改變。因此，迫切需要對KIRC 的敏感基因進行研究，以尋找有效的治療靶點及預后的分子標志物，進而有助于早期診斷，并為KIRC 早期干預提供依據。

植物同源結構域指蛋白6（plant homeodomain finger protein 6，PHF6）定位于人染色體Xq26.3，是一種核仁、核糖體RNA 啟動子相關蛋白，該蛋白具有2 個植物同源結構域[9]，定位于細胞核中，并在脊椎動物中高度保守[10]。PHF6 表達異常與腫瘤發生發展相關，研究表明，PHF6編碼核仁和染色質相關的白血病抑制因子，其表達缺失會導致染色質可及性及核小體定位的局灶性變化[11]，PHF6 表達缺失極大地損害了G2期細胞檢查點的恢復[12]。隨著基因研究的不斷深入，PHF6 在血液病中的作用，特別是對血液腫瘤的抑制作用也逐漸受到關注[13]，并取得了一定的成果。但目前臨床對KIRC 與PHF6 間的關系知之甚少。

本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中KIRC 患者的臨床特征及RNA-seq 高通量測序信息，分析PHF6在KIRC 中的表達及與患者預后的關系，從而分析PHF6表達與KIRC 間的關系，并通過免疫組化法進一步驗證PHF6的表達與腫瘤相關基因間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據來源及處理

從TCGA 數據庫（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）下載535 例KIRC組織及72 例正常腎組織的數據及患者的病歷資料；從基因型-組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數據庫（https://commonfund.nih.gov/gtex）下載28 例正常腎組織的數據及患者的病歷資料。由于部分數據有缺失，共統計到535 例KIRC患者的部分臨床特征、100 例正常腎組織和535 例KIRC 組織的RNA-seq 數據、535 例KIRC 患者的總生存期（overall survival，OS）、532 例KIRC 患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）、530例KIRC 患者的疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）資料。此外，自上海超芯生物科技有限公司購買KIRC 組織及癌旁組織共150 個微陣列的石蠟切片，由于部分矩陣的病歷資料缺失，共統計到146 個微陣列的年齡和性別、148 個微陣列的組織學分級和臨床分期的資料。

首先比較TCGA 數據庫下載的72 例正常腎組織與535 例KIRC 組織中的PHF6表達情況；再加上GTEx 數據庫下載的28 例正常腎組織，比較100例正常腎組織與535 例KIRC 組織中PHF6的表達情況，并比較不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6的表達情況。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估PHF6表達對KIRC 的診斷價值。依據PHF6表達水平的中位數，將TCGA 數據庫中535 例KIRC 患者分為PHF6高表達組和PHF6低表達組，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗，比較兩組患者的OS、PFS、DSS。

1.2 基因本位（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

為探究PHF6調節KIRC 的可能的分子機制，依據PHF6表達水平的中位數，將TCGA 數據庫中535 例KIRC 患者分為PHF6高表達組和PHF6低表達組，利用R 語言的“Limma”包對兩組患者的所有基因進行差異分析，并將|Log Fold Change|＞1 作為共同差異基因。采用DAVID 在線數據庫（https://david.ncifcrf.gov）對上述共同差異基因進行GO 分析，并將共同差異基因中PHF6高表達組的基因提取出來進行KEGG 通路富集分析，通過R 語言的“ggplot2”包進行可視化。

1.3 免疫組化法驗證組織微陣列中相關蛋白與PHF6 表達的相關性

選取KEGG 通路富集分析中的相關基因進行相關性分析，免疫組化法驗證組織微陣列中相關蛋白與PHF6 表達的相關性。選取上海超芯生物科技有限公司購買的75 例KIRC 組織及癌旁組織（共150 個矩陣），經二甲苯及梯度乙醇脫水，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3次，在微波爐內用檸檬酸鹽修復15 min，冷卻至室溫后，TBST 洗滌3 次，免疫組化筆圈出組織，過氧化物酶封閉15 min。滴加稀釋后的山羊血清一抗，4 ℃孵育過夜，室溫復溫30 min，胰蛋白酶標記的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合酶孵育1 h，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色15 min，蘇木素復染15 min，1%酸性乙醇分化液分化2 s，返藍2 min 后，梯度乙醇及二甲苯復水，封片，鏡檢。

判定標準：依據染色強度進行評分，無著色計1 分，淺黃色染色計2 分，黃色或深黃色染色計3分，細胞呈較深黃色且沒有背景著色計4 分，細胞呈深黃色且沒有背景著色計5 分；依據陽性細胞所占比例評分，＜5%計1 分，5%～24%計2 分，25%～49%計3 分，50%～75%計4 分，＞75%計5 分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，1～4 分為陰性，5～8 分為弱陽性，9～12 分為陽性，13～25 分為強陽性；其中1～8 分為低表達，9～25 分為高表達。

1.4 統計學方法

使用R 語言和SPSS 16.0 對所有數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。采用Kaplan-Meier 法評估PHF6高表達組與PHF6低表達組KIRC 患者的生存差異，組間比較采用Log-rank 檢驗；繪制ROC 曲線，計算AUC，評估PHF6表達對KIRC 的診斷價值。采用R 語言中的cor 函數計算相關系數r，驗證組織微陣列中相關蛋白與PHF6 表達的相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常腎組織和KIRC 組織中PHF6 表達情況的比較

TCGA 數據庫中，正常腎組織中PHF6的相對表達量為（2.434±0.051），明顯高于KIRC 組織的（2.011±0.018），差異有統計學意義（t=8.215，P＜0.01）。TCGA 和GTEx 數據庫中，正常腎組織中PHF6的相對表達量為（2.352±0.482），明顯高于KIRC 組織的（2.011±0.018），差異有統計學意義（t=7.417，P＜0.01）。

2.2 TCGA 數據庫中不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達情況的比較

TCGA 數據庫中，不同年齡、性別KIRC 患者KIRC 組織中PHF6表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同臨床分期、組織學分級、腫瘤狀態KIRC 患者KIRC 組織中PHF6表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中術后無新發腫瘤患者的PHF6高表達率高于術后新發腫瘤患者，且隨臨床分期、組織學分級升高，PHF6高表達率逐漸降低。（表1）

表1 TCGA 數據庫中不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達情況的比較

2.3 組織微陣列中不同臨床特征KIRC 患者KIRC組織中PHF6 表達情況的比較

組織微陣列中，不同年齡、性別、組織學分級情況KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同臨床分期KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 組織微陣列中不同臨床特征KIRC 患者KIRC 組織中PHF6 表達情況的比較

2.4 PHF6 表達水平對KIRC 的診斷價值

ROC 曲線顯示，KIRC 組織中PHF6表達水平診斷KIRC 的AUC 為0.730（95%CI：0.672～0.782），靈敏度為77.80%，特異度為58.90%。（圖1）

圖1 PHF6表達診斷KIRC的ROC曲線

2.5 預后情況的比較

依據PHF6表達水平的中位數，將TCGA 數據庫中KIRC 患者分為PHF6高表達組和PHF6低表達組，Kaplan-Meier 法評估不同PHF6表達情況KIRC 患者生存情況的差異，結果顯示，PHF6高表達組患者的中位OS、PFS、DSS 均長于PHF6低表達組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2～圖4）

圖2 PHF6高表達組（n=268）與PHF6低表達組（n=267）KIRC患者的OS曲線

圖3 PHF6高表達組（n=266）和PHF6低表達組（n=266）KIRC患者的PFS曲線

圖4 PHF6高表達組（n=265）和PHF6低表達組（n=265）KIRC患者的DSS曲線

2.6 GO 分析和KEGG 通路富集分析

為研究PHF6參與KIRC 發生發展的可能分子機制，對TCGA 數據庫中PHF6高表達組和PHF6低表達組KIRC 患者的基因進行分析，結果共篩選出750 個差異基因，其中300 個相對PHF6表達上調，450 個相對PHF6表達下調。GO 分析結果顯示，差異基因的生物過程主要集中于體液免疫應答、補體激活和B 細胞介導的免疫上，細胞成分主要集中于免疫球蛋白復合物、含膠原蛋白的細胞外基質、細胞的頂端部分和血液微粒上，分子功能主要集中于抗原結合、糖胺聚糖結合和硫化合物結合上。將共同差異基因中PHF6高表達組的基因提取出來進行KEGG 通路富集分析，結果顯示，PHF6高表達的KEGG 通路主要集中于膽固醇代謝、白細胞介素-17 信號通路和類固醇激素生物合成中，表明PHF6可能通過生物代謝與合成、炎癥反應影響免疫調節與應答，調節KIRC 的發展進程。（圖5、圖6）

圖5 差異基因的GO分析

圖6 差異基因的KEGG富集分析

2.7 免疫組化法驗證組織微陣列中相關蛋白與PHF6 表達的相關性

選取KEGG 免疫相關的信號通路中參與KIRC發生發展的基因，探討其與PHF6表達的相關性，從而進一步推斷PHF6在KIRC 中的作用。參與腫瘤調節的基因如肌醇1，4，5-三磷酸2 型受體（inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2，ITPR2）（是促進細胞衰老、減少細胞增殖的基因）、磷脂酶A2組ⅣA（phospholipase A2 group ⅣA，PLA2G4A）（是介導溶酶體損傷的基因）、前列腺素F 受體（prostaglandin F receptor，PTGFR）（是抗血管生成的基因）、核糖體蛋白S6 激酶A6（ribosomal protein S6 kinase A6，RSK4）（是抑癌基因），均與PHF6的表達呈正相關（r=0.52、0.34、0.50、0.42，P＜0.01）。表明PHF6與ITPR2、PLA2G4A、PTGFR、RSK4 在KIRC 中的作用相似，可以抑制KIRC 細胞的生長。

通過免疫組化法驗證組織微陣列中RSK4 與PHF6 表達的相關性，由2 名研究者獨立對染色后的組織微陣列中PHF6 蛋白和RSK4 蛋白的陽性細胞所占比例和染色強度進行綜合評分，結果顯示，RSK4 蛋白的表達與PHF6 蛋白的表達呈正相關（r=0.557，P＜0.01），表明PHF6 蛋白可能通過調節RSK4 蛋白的表達抑制KIRC 細胞的生長。（圖7）

圖7 組織微陣列中KIRC患者KIRC組織中PHF6與RSK4的表達情況（免疫組化染色，×10）

3 討論

PHF6的表達水平對KIRC 患者的預后有重要意義。近年來，隨著生物信息學技術的飛速發展，通過大數據分析某些或某類基因在疾病中的作用，可以為疾病的發生發展、治療和預后評估等提供新思路。KIRC 與免疫微環境、腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學改變有關，這些改變均可導致多個腫瘤相關基因表達水平的改變。目前，雖然已經開發了新的診斷手段提高KIRC 的診斷率，但由于KIRC 起病隱匿、腫瘤標志物較少，KIRC 患者的早期診斷效率仍較差[7]；因此，為尋找新的早期診斷和預后評估的生物標志物，本研究對TCGA 數據庫中KIRC 患者的病歷資料和RNA-seq 數據進行了分析。

本研究首先分析了TCGA 數據庫中KIRC 患者的臨床特征，結果顯示，PHF6表達水平與KIRC 患者的臨床分期、組織學分級、腫瘤狀態有關；且與正常腎組織相比，PHF6在KIRC 組織中表達下調。然后本研究繪制ROC 曲線推斷PHF6表達水平對KIRC 的診斷效能，結果顯示，PHF6表達水平診斷KIRC 的AUC 為0.730（95%CI：0.672～0.782），靈敏度為77.80%，特異度為58.90%。Kaplan-Meier分析發現，PHF6高表達組患者的中位OS、PFS、DSS 均長于PHF6低表達組患者，提示PHF6的表達水平可能對KIRC 患者的預后有指示作用。

目前，臨床對PHF6 如何參與KIRC 的發生發展過程仍知之甚少，為進一步研究PHF6在KIRC中的生物學功能，本研究依據PHF6 表達水平的中位數，對PHF6高表達組和PHF6低表達組KIRC 患者的差異基因進行GO 分析，結果顯示，PHF6表達與體液免疫應答、B 細胞受體信號通路、抗原結合和補體激活有關，提示PHF6基因主要富集在免疫相關通路上，且可能對免疫相關通路存在促進作用；將共同差異基因中PHF6高表達組的基因提取出來進行KEGG 富集分析顯示，PHF6高表達的KEGG 通路主要集中于膽固醇代謝、白細胞介素-17 信號通路和類固醇激素生物合成中，表明PHF6可能通過生物代謝與合成、炎癥反應影響免疫調節與應答，調節KIRC 的發展進程。有研究證實，T細胞的衰竭是導致KIRC 組織免疫抑制的關鍵因素，且與患者的不良預后有關[8]。既往研究證實，ITPR2對衰老和凋亡的觸發有重要貢獻[14]；PLA2G4A的下調減弱了腫瘤細胞的上皮-間充質轉化過程，抑制了腫瘤細胞的生長和轉移[15-16]；PTGFR甲基化改變可以將轉錄調控重新定位到腫瘤組織，從而抑制腫瘤進展[17]；RSK4與多種腫瘤患者的生存期有關[18-19]。本研究選取上述基因與PHF6的表達水平進行相關性分析，并通過免疫組化方法驗證組織微陣列中RSK4 的表達與PHF6 表達的關系，結果發現，TPR2、PLA2G4A、PTGFR和RSK4均與PHF6的表達水平呈正相關，且RSK4 蛋白的表達與PHF6 蛋白的表達呈正相關。

綜上所述，與正常腎組織相比，PHF6 在KIRC組織中表達下調，PHF6 高表達KIRC 患者的預后較好，RSK4 的表達與PHF6的表達呈正相關。可以根據PHF6的表達水平，對KIRC 患者進行干預，有必要將其作為KIRC 的候選生物標志物。