醛固酮受體拮抗劑螺內酯減輕肢體缺血再灌注致心肌損傷的信號傳導機制

郭 悅,劉純興

肢體缺血再灌注是臨床常見的病理損傷類型,肢體局部組織缺血后易發生再灌注損傷,并損傷其他遠端器官[1]。其中心肌組織是缺血再灌注損傷的敏感器官,主要是在肢體再灌注損傷過程中釋放大量的活性氧或炎性因子,并在心肌組織聚集大量中性粒細胞,導致心肌損傷[2]。醛固酮是由腎上腺皮質球狀帶合成并分泌的一種類固醇激素,具有調節水鹽代謝及改善血壓的功效,在心血管疾病的發生、發展中發揮著重要作用[3]。因此,醛固酮可能是心肌缺血再灌注損傷過程中的主要病理因素,采用醛固酮受體拮抗劑可有效拮抗醛固酮釋放,并抑制炎性介質、黏附因子釋放,減少心肌細胞凋亡,緩解心肌炎癥狀。螺內酯在肢體缺血再灌注致心肌損傷中的作用機制尚未明確。本研究通過建立肢體缺血再灌注模型,分析醛固酮受體拮抗劑螺內酯對肢體缺血再灌注致心肌損傷的作用,探討其作用信號通路,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 30只健康Wistar雄性大鼠,由河北省實驗動物中心提供,8月齡,體質量210～260 g;常規條件下正常飼養。螺內酯購自江蘇宜興前進制藥廠;Nikon攝影生物光學顯微鏡(日本日立公司)、DF-205恒溫干燥箱(北京西城區醫療器械二廠)。

1.2 制備動物模型 將30只健康Wistar雄性大鼠隨機分為對照組(10只,正常飼養)、再灌注組(10只,建立肢體缺血再灌注大鼠模型)、螺內酯組(10只,建立模型前給予螺內酯)。利用橡皮圈環繞大鼠雙后肢根部并進行結扎,阻斷4 h,之后松解橡皮圈,再恢復血流灌注4 h。松解橡皮圈15 min前,腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)進行麻醉,于左側頸外置管注射肝素后進行抗凝血。對照組雙后肢用橡皮圈松弛環繞未阻斷血流,4 h后取下橡皮圈,并恢復血流4 h。血流恢復后麻醉并處死大鼠。螺內酯組大鼠建立模型前,連續6 d進行螺內酯灌胃,每次20 mg/kg,6 d后成功建立動物模型并處死。

1.3 觀察指標

1.3.1 心肌組織形態 麻醉處死大鼠后,留取心肌組織,石蠟包埋,組織切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微光鏡下觀察心肌組織形態學改變。計算心肌細胞凋亡數,細胞核為棕褐色或為棕黃色,伴有凋亡細胞形態學。隨機選擇5個視野,每個視野極端陽性細胞占全部心肌細胞的百分比,計算凋亡百分比。

1.3.2 血清炎性因子 麻醉處死3組大鼠后留取血漿約6 mL及心肌組織,采用酶聯免疫吸附法檢測白細胞介素(IL)-6、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達,試劑盒由武漢優爾生物科技股份公司提供。

1.3.3 血清心肌酶表達 采用全自動生化分析儀(日本HITACHI7200型)檢測肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)表達。

1.3.4 心肌組織氧化應激指標 留取心肌組織,加入冷生理鹽水制備為10%組織勻漿,離心10 min,以3 000 r/min,收集上清液,采用放射免疫法檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX),試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.5 相關基因表達 采用免疫組化法測定心肌組織HMGB1 mRNA表達、Toll樣受體4(TLR4) mRNA表達。

2 結 果

2.1 3組心肌組織形態學變化及心肌細胞凋亡率比較 對照組心肌纖維排列整齊,細胞核均勻一致,心肌細胞紋理清楚;再灌注組心肌細胞腫脹、變性,細胞質紅染,細胞核數量明顯減少,心肌纖維壞死斷裂,間隙增加,周圍組織存在炎性細胞浸潤、炎性物質滲出。螺內酯組心肌纖維排列較再灌注組整齊,間隙寬度縮小,心肌細胞呈輕微腫脹。對照組大鼠心肌細胞凋亡率為(5.28±1.05)%,再灌注組為(185.47±35.85)%,螺內酯組為(75.25±24.19)%,3組比較差異有統計學意義(F=131.575,P<0.001)。

2.2 3組大鼠血清心肌酶表達比較 再灌注組、螺內酯組血清cTnI、CK、CK-MB表達較對照組增加;螺內酯組血清cTnI、CK、CK-MB表達低于再灌注組,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠血清心肌酶表達比較(±s)

2.3 3組大鼠心肌組織氧化應激指標比較 再灌注組、螺內酯組心肌組織內MDA表達較對照組升高,SOD、GSH-PX含量較對照組降低;螺內酯組心肌組織內MDA表達低于再灌注組,SOD、GSH-PX含量高于再灌注組,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠心肌組織氧化應激反應指標比較(±s)

2.4 3組大鼠心肌與血漿IL-6、HMGB1表達比較 再灌注組、螺內酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1表達均高于對照組;螺內酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1表達均低于再灌注組,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組大鼠心肌與血漿IL-6、HMGB1表達比較(±s)

2.5 3組大鼠心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達比較 再灌注組、螺內酯組心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達高于對照組;螺內酯組心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達低于再灌注組,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 3組大鼠心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達比較(±s)

3 討 論

肢體缺血再灌注損傷的病理過程復雜,通常再灌注損傷后釋放大量氧自由基及炎性物質,導致大量細胞凋亡,造成除了肢體以外遠隔器官損傷[4]。心肌組織是肢體缺血再灌注損傷后主要累及的敏感器官,可能是體內釋放的大量氧自由基、炎性因子經血液循環到心肌組織,導致心肌組織損傷及心肌功能降低[5-6]。本研究建立肢體缺血再灌注損傷大鼠模型后心肌細胞腫脹、變性,細胞質紅染,細胞核數量減少,心肌纖維壞死斷裂,間隙增加,周圍組織存在炎性細胞浸潤、炎性物質滲出。說明肢體缺血再灌注損傷易誘發心肌損傷。螺內酯組心肌細胞凋亡率為(75.25±24.19)%,低于再灌注組的(185.47±35.85)%,差異有統計學意義(P<0.05)。因此,采用螺內酯提前給藥處理,可減輕心肌損傷,減少心肌細胞凋亡數量。本研究結果也顯示,螺內酯組血清cTnI、CK、CK-MB表達低于再灌注組(P<0.05)。結果證實螺內酯可減輕心肌損傷。

脂質過氧化是心肌細胞損傷的重要因子,其中MDA是細胞膜脂質過氧化的代謝終產物,其表達與脂質過氧化程度密切相關,可反映氧自由基水平[7];SOD、GSH-PX是機體防御自由基損傷的重要系統,是清除氧自由基表達、減輕組織器官損傷的重要因子[8]。本研究結果顯示,再灌注組,螺內酯組心肌組織內MDA表達較對照組升高,SOD、GSH-PX含量較對照組降低;螺內酯組心肌組織內MDA表達低于再灌注組,SOD、GSH-PX含量高于再灌注組(P<0.05)。表明肢體缺血再灌注后處于強烈的氧化應激狀態,采用螺內酯治療可減輕機體氧化應激反應程度。由于肢體缺血再灌注后抗氧化酶含量及自由基清除酶系統活性降低,脂質過氧化系統激活,導致心肌組織處于高度的氧化應激狀態[9-10]。炎癥反應方面,再灌注組、螺內酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1表達及心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達均高于對照組;螺內酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1及心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達均低于再灌注組(P<0.05)。提示肢體缺血再灌注后處于強烈的炎癥反應狀態,導致心肌細胞損傷。

分析具體的作用機制：螺內酯通過結合心肌細胞膜上受體,激活磷脂酶C,以此升高細胞質內鈣離子濃度,迅速激活蛋白激酶C,降低線粒體膜通透性,抑制氧化應激反應,減輕心肌細胞損傷[11-12];螺內酯抑制心肌細胞凋亡,延緩心肌細胞死亡,抑制心肌重構,以此延緩心肌損傷過程[13]。其作用信號傳導主要是抑制HMGB1-TLR4信號通道,TLR4表達在心血管系統中升高,TLR4激活后可正向調控炎癥信號通路,導致血管重構、內皮細胞損傷及心肌細胞凋亡,與心肌缺血再灌注損傷、心肌炎等多種疾病關系密切[14]。HMGB1是一種核蛋白,廣泛存在于所有細胞內,是TLR4的重要配體,釋放后與TLR4結合,促進體內固有免疫信號通路的活性,釋放大量炎性因子,導致組織或器官損傷[15]。螺內酯通過下調HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達,抑制炎癥反應,并拮抗醛固酮作用,減輕氧化應激反應,緩解心肌細胞損傷。

綜上所述,肢體缺血再灌注后常導致心肌損傷,采用螺內酯治療可減輕心肌損傷程度,可能是通過抑制氧化反應、抗炎癥反應減輕心肌損傷程度,其作用信號傳導通路主要是抑制HMGB1-TLR4信號通道及炎癥反應,發揮緩解心肌損傷的作用,但具體機制需進一步研究。