Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化五味子醇甲提取工藝

艾佳佳，黃慧芝，劉海燕，侯春久，湯燦輝，陳文

1.江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校（撫州 334400）；2.臨川區(qū)第一人民醫(yī)院（撫州 334400）

五味子臨床用于治療肝炎、抗腫瘤及抗病毒等[1]，是由于其含有木脂素類成分[2]，其中以含量較高，具有聯(lián)苯木脂素的五味子醇甲為代表。五味子醇甲提取工藝中，采用最頻繁的方法為加熱回流提取法，該提取工藝較為成熟，但存在一些不足，如提取時(shí)間長(zhǎng)、消耗能源大及操作較繁瑣等[3]。

超聲提取法是一種采用超聲波能量，破壞植物藥材的細(xì)胞，并幫助溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解天然藥物化學(xué)成分的一種提取方法。該方法操作簡(jiǎn)單，成本較低，高效便捷[4]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-M20A型檢測(cè)器、CTO-20A型柱溫箱、SIL20A型自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司）；MS105DU型分析天平（梅特勒托利多有限公司）；BAS2202S型電子天平（賽多利斯公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

五味子醇甲對(duì)照品（含量99.7%，批號(hào)110857-201815，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；五味子（江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院）；β-環(huán)糊精（批號(hào)20201007，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；無(wú)水乙醇（分析純）；甲醇（色譜純）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 五味子醇甲含量測(cè)定分析方法的建立

1.3.1.1 含量測(cè)定方法

1.3.1.1.1 色譜條件的確定

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水（13︰7）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm[6]。

1.3.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量五味子醇甲對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制備成每1 mL含1 514.00 μg的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.1.1.3 供試品溶液的配制

五味子打粉，精密稱取，置于10 mL容量瓶中，加甲醇，定容，超聲，至五味子充分溶解，補(bǔ)充甲醇，至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.1.2 含量測(cè)定方法學(xué)考察

1.3.1.2.1 線性關(guān)系考察

取五味子醇甲對(duì)照品母液，分別精密吸取1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，取0.45 μm微孔濾膜，過(guò)濾，取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀，檢測(cè)。以峰面積y為縱坐標(biāo)，濃度x為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，其回歸方程為y=29.571x+3 410.9，R2=0.998 8。

1.3.1.2.2 精密度考察

取10 μL同一對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，五味子醇甲對(duì)照品溶液SRSD為0.88%，說(shuō)明高效液相儀器精密度良好。

1.3.1.2.3 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，常溫放置，分別于0，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣分析，注入液相色譜儀進(jìn)樣分析，SRSD為0.79%，說(shuō)明穩(wěn)定性良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.1.2.4 重復(fù)性考察

按上述供試品溶液配制方法制備，平行制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，計(jì)算得出五味子醇甲含量SRSD為0.89%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

1.3.1.2.5 加樣回收率考察

精密吸取6份10 mL含量相同的供試品，精密加入10 mL五味子醇甲對(duì)照品，混合均勻，注入液相色譜儀進(jìn)樣分析，SRSD為0.55%。

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化五味子醇甲提取工藝

1.3.2.1 五味子醇甲的提取

將五味子粉碎過(guò)篩，加入一定量的β-環(huán)糊精，與一定量的溶劑混勻，超聲提取，提取液過(guò)濾。

1.3.2.2 單因素試驗(yàn)

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[6]，并進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)考察，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、β-環(huán)糊精加入量、提取時(shí)間3個(gè)因素作為自變量，五味子醇甲提取率作為因變量。各因素的水平梯度設(shè)置：乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，60%，80%和100%；β-環(huán)糊精加入量為0，10%，15%和20%；提取時(shí)間為10，20，30，40和50 min。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選出主要影響因素，根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)五味子醇甲提取工藝，建立最優(yōu)工藝。

1.3.2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)考察基礎(chǔ)上，依據(jù)各因素對(duì)五味子醇甲提取率的影響，選取適當(dāng)?shù)淖宰兞浚晕逦蹲哟技滋崛÷蕿樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)，依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果擬合二次多項(xiàng)式方程，并建立響應(yīng)面模型，預(yù)測(cè)最佳五味子醇甲提取工藝及五味子醇甲提取率。試驗(yàn)因素及各水平見(jiàn)表1。

表1 五味子提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.3.2.4 最優(yōu)處方驗(yàn)證

根據(jù)Design Expert軟件所給出的最優(yōu)提取工藝預(yù)測(cè)各因素的最優(yōu)值，計(jì)算五味子醇甲提取率，與軟件所給出的預(yù)測(cè)值對(duì)比，驗(yàn)證軟件的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜圖

五味子醇甲對(duì)照品、五味子醇甲樣品色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖1（a）可知，五味子醇甲在保留時(shí)間8.234 min出現(xiàn)色譜峰。由圖1（b）可知，樣品中含有五味子醇甲，且在保留時(shí)間8.363 min出現(xiàn)色譜峰。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)五味子醇甲提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，五味子醇甲提取率增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，五味子醇甲提取率達(dá)到最大。乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，五味子醇甲提取率反而減少。因此，選擇80%乙醇作為響應(yīng)面中心點(diǎn)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)五味子醇甲提取率的影響

2.2.2β-環(huán)糊精加入量對(duì)五味子醇甲提取率的影響

由圖3可知，隨著β-環(huán)糊精加入量的增加，五味子醇甲提取率增加，當(dāng)β-環(huán)糊精加入量為10%時(shí)，五味子醇甲提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加β-環(huán)糊精的質(zhì)量，五味子醇甲提取率反而降低。因此選擇10%β-環(huán)糊精加入量為中心點(diǎn)。

圖3 β-環(huán)糊精加入量對(duì)五味子醇甲提取率的影響

2.2.3 提取時(shí)長(zhǎng)對(duì)五味子醇甲提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，五味子醇甲提取率增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，五味子醇甲提取率保持穩(wěn)定。故選擇30 min作為響應(yīng)面提取時(shí)間中心點(diǎn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)五味子醇甲提取率的影響

2.3 五味子醇甲的提取工藝優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6對(duì)表2中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合，得到二項(xiàng)式擬合方程：Y=0.68-0.021A+0.021B+0.014C-0.014AB-0.012AC-8.672×10-3BC-0.027A2-0.019B2-2.468×10-3C2。

表2 提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知：該模型P=0.015 7＜0.01，表明模型顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型擬合度良好。由方差分析可知，自變量1次項(xiàng)A、B以及二次項(xiàng)A2顯著（P＜0.05），表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 提取工藝方差分析

固定三個(gè)變量之一為中值，繪制提取率的效應(yīng)曲面圖。由圖5可知，與C方向比較，B效應(yīng)面更陡，說(shuō)明β-環(huán)糊精對(duì)五味子醇甲提取率的影響要大于提取時(shí)間。各因素的交互作用，由圖5~圖7等高線的形狀及響應(yīng)曲線的陡峭程度可以得出，各因素的相互作用不顯著。

圖5 β-環(huán)糊精加入量與提取時(shí)間對(duì)五味子醇甲提取率影響的等高線圖與響應(yīng)曲面圖

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)五味子醇甲提取率影響的等高線圖與響應(yīng)曲面圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與β-環(huán)糊精加入量對(duì)五味子醇甲提取率影響的等高線圖與響應(yīng)面圖

2.3.2 提取工藝條件優(yōu)化預(yù)測(cè)

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化所得的五味子醇甲最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)72.40%、β-環(huán)糊精含量12.98%、提取時(shí)間40.00 min，五味子醇甲提取率為0.71%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在其他因素固定不變的條件下，按照最優(yōu)提取工藝預(yù)測(cè)：乙醇體積分?jǐn)?shù)72.40%、β-環(huán)糊精含量12.98%、提取時(shí)間40.00 min，五味子醇甲提取率為0.689%，0.701%和0.698%（n=3），SRSD值分別為0.25%，0.37%和0.46%，表明該驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、β-環(huán)糊精加入量為考察因素，以五味子醇甲提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)提取條件優(yōu)化，建立多元線性模型，并繪制效應(yīng)面圖，得到最優(yōu)提取條件。驗(yàn)證五味子醇甲最優(yōu)提取條件，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，最優(yōu)提取條件能明顯提高五味子醇甲提取率。此次試驗(yàn)為五味子醇甲提取率相關(guān)影響因素的探究提供理論依據(jù)和工藝參考。