響應面法優化復合涂膜對鮮切蘋果保鮮

武晉海，張苗靖，謝甜鴿，張新麗，田雪艷，朱志強

1.山西師范大學食品科學學院（太原 030000）；2.東北林業大學林學院（哈爾濱 150000）；3.鈦和檢測認證集團山西中譜安信質檢技術服務有限公司（臨汾 041000）；4.國家農產品保鮮工程技術研究中心，農業農村部農產品貯藏保鮮重點實驗室（天津 300384）

我國是水果生產大國，產量穩居世界第一，2020年人均水果占有量達到了200 kg以上；水果富含維生素，是繼谷物后碳水化合物攝入的重要來源。鮮果采后除直接食用外，鮮切和制汁等精深加工在滿足居民多樣性消費發揮了重大的作用。特別是隨著我國農業和產業結構的調整及人民消費水平的提高、生活節奏的明顯加快，鮮切水果產品逐漸形成產業化發展模式，擁有廣闊的發展空間[1-3]。鮮切水果作為即時性食品，經切分等加工過程后，極易變色、變味等，從而大大降低消費口感和觀感，如蘋果切分后，機械創傷面在空氣下祼露，真菌等微生物會快速侵入受損的蘋果組織，利用蛋白質等營養成分而進行大量繁殖，造成品質不斷下降，加速腐爛。如何抑制鮮切果蔬貯藏期品質的快速下降，篩選適宜的保鮮處理方式，減少其損失，對指導生產減損具有十分重要的意義。

殼聚糖常用于水果采后涂膜保鮮加工處理，但其不溶于水，需醋酸等酸性溶劑溶解，會對鮮切果蔬的風味產生不利的影響[4]。殼寡糖為低聚殼聚糖，具有水溶性極佳、成膜性良好且防腐抗菌能力優越的特點，同時它安全無毒、食用后不會對人體造成不良影響，在果蔬涂膜保鮮的應用中，是殼聚糖的良好替代品。目前，殼寡糖在果蔬如草莓[5-7]、梨果采后保鮮已有研究，對果蔬涂膜后的失重率、硬度、可溶性固形物和可滴定酸含量及貯藏品質的下降抑制作用顯著[8-9]。將殼寡糖作用于鮮切果蔬并對果蔬貯藏品質影響的研究鮮有報道。乳酸菌素常用作食品天然防腐劑，多用于部分肉制品的防腐[10]，可以抑制食品中一些致病、致腐的革蘭氏陽性菌，如霉菌等。茶多酚（SA）普遍存在于植物中，可明顯抑制果蔬產生乙烯，有助于抵抗微生物，最終改善果實品質[11-14]，在櫻桃、辣椒等上有研究效果顯著。文章將以山西省吉縣蘋果為原料，采用可食用的乳酸菌素、殼寡糖、茶多酚三種天然防腐劑復合使用，以多酚氧化酶活性、黃酮、失重率為檢測指標，經單因素試驗后，通過響應面法優化三種試劑復合處理后對鮮切蘋果的保鮮效果，避免單一使用無法較全面地解決果蔬保鮮過程中的污染問題[15-18]，以期為鮮切蘋果貯藏期防腐保鮮提供優化方案，促進鮮切果蔬消費。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

蘋果（山西省吉縣）；蒸餾水，無水乙醇、磷酸緩沖液（pH 6.4）、鄰苯二酚、三氯化鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、蘆丁標準品、次氯酸（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；乳酸菌素、殼寡糖、茶多酚等均為食品級（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；聚乙烯（PE）保鮮膜（食品級，4 μm），超市購買。

1.2 儀器與設備

FA1204B分析天平（上海越平科學儀器有限公司）；TGL-16C離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州天瑞儀器有限公司）；UV-5100B紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

2 試驗方法

2.1 蘋果復合涂膜工藝

新鮮蘋果→清洗消毒→切片→浸泡上膜→自然風干成膜→裝袋→真空封口→4 ℃冰箱中儲藏

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同濃度殼寡糖對多酚氧化酶活性的影響

定量稱取殼寡糖，分別配制1%，15%和2%的殼寡糖溶液，攪拌至充分溶解，將挑選好的蘋果進行清洗消毒，切片，再將挑選好的蘋果片進行各濃度梯度保鮮涂膜處理浸泡5 min。待涂層自然風干，以保鮮膜封裝，放入4 ℃貯藏，以水處理作為空白對照。開始貯藏后，每隔一天取出樣品進行多酚氧化酶活性的測定，考察不同濃度殼寡糖對多酚氧化酶活性的影響。

2.2.2 不同濃度乳酸菌素對多酚氧化酶活性的影響

定量稱取乳酸菌素，分別配制0.005%，0.01%和0.15%的乳酸菌素溶液，攪拌至充分溶解，將挑選好的蘋果進行清洗消毒，切片，再將挑選好的蘋果片進行各濃度梯度保險涂膜處理浸泡5 min，待涂層自然風干后，以保鮮膜裝袋，放入4 ℃貯藏，以水處理作為空白對照。開始貯藏后，每過一天取出樣品進行多酚氧化酶活性的測定，考察不同濃度乳酸菌素對多酚氧化酶活性的影響。

2.2.3 不同濃度茶多酚對多酚氧化酶活性的影響

定量稱取茶多酚，分別配制1%，1.5%和2%的茶多酚溶液，攪拌至充分溶解，將挑選好的蘋果進行清洗消毒，切片，再將挑選好的蘋果片進行各濃度梯度保險涂膜處理浸泡5 min，待涂層自然風干后，以保鮮膜裝袋，放入4 ℃貯藏，以水處理作為空白對照。開始貯藏后，每過一天取出樣品進行多酚氧化酶活性的測定，考察不同濃度茶多酚對多酚氧化酶活性的影響。

2.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken進行試驗設計[10]。以殼寡糖、乳酸菌素、茶多酚三個影響因素為自變量，每個因素取三個水平，以多酚氧化酶活性、黃酮、失重率為響應值，試驗因素水平及編碼設計見表1。通過軟件Design-Expert 8.0.6對結果進行分析，建立二次回歸方程，優化后得到數學模型。

表1 響應面因素水平表 單位：%

2.4 測定指標

2.4.1 PPO活性

將樣品1 min內所測吸光度的0.01改變記為一動態活力單位（U）。配制酶提取液，并與磷酸緩沖液、鄰苯二酚混合，在420 nm波長處測定反應混合液的吸光度（A）的變化并記錄，以磷酸緩沖液調零，酶活力按式（1）計算。

式中：t為反應時間，min；W為所取鮮果質量，g。

2.4.2 總黃酮

繪制標準曲線[19]，確定適宜濃度范圍，吸取樣液或標準溶液于容量瓶中，加入蒸餾水、亞硝酸鈉溶液、鋁鹽溶液，搖勻放置，加入氫氧化鈉溶液，搖勻后用蒸餾水定容，測定500 nm吸光度（A500）。樣品總黃酮含量以鮮質量計。

2.4.3 失重率

采用稱重法測定。失重率按式（2）計算。

式中：m1為貯藏前樣品質量，g；m2為不同貯藏期的樣品質量，g。

2.5 數據處理

利用Design-Expert軟件（Version 8.05 Stat-Ease Inc.MN，USA）對響應面試驗結果進行線性回歸和方差分析（P＜0.05）。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 不同濃度殼寡糖對鮮切蘋果中多酚氧化酶活性的影響

由圖1可知：隨著貯藏時間的延長，鮮切蘋果的多酚氧化酶活性均呈上升趨勢，3 d后，CK，1%和2%濃度處理增加趨勢明顯增加，第6天時上升至最大值293，205和147 U。1.5%殼寡糖處理的蘋果，多酚氧化酶活性上升趨勢變緩慢且低于其他水平，第6天時上升至121 U，說明濃度的增加抑制多酚氧化酶活性作用增強。其中，1.5%濃度的殼寡糖溶液處理的蘋果多酚氧化酶活性最低。第7天后均呈現出下降趨勢，可能是因為適宜濃度的殼寡糖抑制了蘋果的呼吸作用[20]，從而使多酚氧化酶活性低于CK及其他處理，從而保持了蘋果品質。可見，殼寡糖在鮮切蘋果的保鮮過程中濃度不宜過大，否則降低使用效果。

圖1 不同濃度殼寡糖處理對鮮切蘋果多酚氧化酶活性的影響

3.1.2 不同濃度乳酸菌素對鮮切蘋果中多酚氧化酶活性的影響

如圖2所示：不同濃度乳酸菌素處理過的鮮切蘋果隨著貯藏時間的延長，多酚氧化酶活性不斷上升，第6天時達到最大值293，232，138和120 U，與CK相比，乳酸菌素溶液處理組多酚氧化酶活性呈較低水平，尤其0.01%濃度下乳酸菌素溶液組活性最低。此外，第6天后，各組均處于下降的趨勢，下降趨勢為CK＞0.005%＞0.015%＞0.01%。由上可知，由益生菌代謝產生的乳酸菌素表現出了明顯的抑菌效果，其中0.01%抑制效果最明顯，從而對鮮切蘋果組織起到了保鮮、抗氧化作用。

圖2 不同濃度乳酸菌素處理對鮮切蘋果多酚氧化酶活性的影響

3.1.3 不同濃度茶多酚對鮮切蘋果中多酚氧化酶活性的影響

圖3表明：貯藏期間，多酚氧化酶活性呈不斷上升趨勢，CK，1%和2%濃度處理貯藏至第6天時上升至最大值293，222和144 U，且各濃度茶多酚處理下鮮切蘋果中多酚氧化酶活性均低于CK，增長趨勢也較為平緩。其中以1.5%溶液處理后的多酚氧化酶活性最低，第6天時上升至121 U，這與茶多酚的抑菌性密不可分[21]，極大程度上保持了蘋果的品質。此外，從圖3變化趨勢來看，1.5%濃度茶多酚處理的蘋果中多酚氧化酶活性在第7天仍然呈增長趨勢，而2%濃度茶多酚處理的蘋果中多酚氧化酶活性呈下降趨勢。

圖3 不同濃度茶多酚處理對鮮切蘋果多酚氧化酶活性的影響

3.2 響應面試驗結果與分析

3.2.1 響應面試驗設計及結果

利用Design-Expert分析軟件，采用Box-Behnken設計試驗，依據響應面試驗設計分別測定不同配比濃度下鮮切蘋果的失重率、多酚氧化酶活性、總黃酮含量，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

3.2.2 回歸模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對表2中的試驗數據進行二次多項回歸擬合，3個因變量失重率（Y1）、多酚氧化酶活性（Y2）、總黃酮（Y3）經過擬合，得到回歸方程，如式（3）~（5）所示。

結果顯示，失重率（Y1）、多酚氧化酶活性（Y2）、總黃酮（Y3）3個響應值可通過線性模型進行擬合，對響應值建立的模型的決定系數R2分別為0.954 6，0.978 5和0.968 3，說明線性模型對上述3項檢測指標響應值隨乳酸菌素、茶多酚、殼寡糖三個自變量變化趨勢的擬合度都較好，校正系數，失重率Radj2=0.933 7，多酚氧化酶活性Radj2=0.917 5、總黃酮Radj2=0.957 5，說明所選因素模型擬合度良好，可用于推測試驗結果；多酚氧化酶活性變異系數（C.V.）= 9.13、總黃酮變異系數（C.V.）=5.77，說明模型重現性好。

3.2.3 因素分析

各配方的失重率、多酚氧化酶活性、總黃酮含量的回歸模型方差分析結果見表3~表5。

表3 失重率回歸模型方差分析

表4 多酚氧化酶活性回歸模型方差分析

表5 總黃酮回歸模型方差分析

涂膜處理在一定程度上降低了鮮切蘋果貯藏期間的蒸騰作用，減少了果實水分的損失，不同涂膜處理的果實水分損耗程度不同[22]。從表3可以看出：根據F值大小可對A、B、C三種涂膜材料對失重率的影響排序：A＞B＞C，即乳酸菌素＞茶多酚＞殼寡糖；因素A對失重率有極顯著影響，P＜0.01，差異極顯著，失擬項P=0.056 6，差異不顯著，這說明試驗誤差較小，一次項A的P值小于0.01，達到了極顯著水平，交互項AB的P值＜0.05，達到了顯著水平；A2、B2達到顯著水平。

從表4可以看出：根據F值的大小可知A、B、C三種涂膜材料對多酚氧化酶活性的影響排序為C＞A＞B，即殼寡糖＞乳酸菌素＞茶多酚；因素C對失重率有極顯著影響，P＜0.000 1，失擬項P=0.453 1，差異不顯著，這說明試驗誤差較小，一次項C的P值＜0.01，達到了極顯著水平，交互項AB的P值＜0.05；A2、B2、C2的P＜0.01，達到了極顯著水平。

從表5可以看出：根據F值的大小可知A、B、C三種涂膜材料對總黃酮的影響排序為A＞C＞B，即乳酸菌素＞茶多酚＞殼寡糖；因素B、C對總黃酮有顯著影響，因素A對總黃酮有極顯著影響，交互項AC及二次項A2、B2、C2的P值＜0.01，達到了極顯著水平。

3.2.4 響應面分析

響應面坡度陡峭程度和等高線圖足夠反映各因素對各指標的影響，坡度陡峭程度和等高線的形狀均可反映出各交互作用的顯著性。兩因素交互項的三維圖越陡峭，等高線呈橢圓則表明這兩因素的交互項對響應面的影響越顯著，反之，等高線近似圓形，則說明兩要素交互作用不明顯，相互影響較小[23-26]。

3.2.4.1 失重率

由圖4可知，AB的等高線圖為橢圓，說明交互作用對失重率的影響較大，在凹點處，失重率達到最低，保鮮效果最佳。回歸方程模型的方差分析結果與響應面圖反映的各因素之間交互作用結果一致。

圖4 各因素交互作用對失重率影響的響應面圖

3.2.4.2 多酚氧化酶活性

從圖5可以看出，AB的等高線圖為橢圓形，AB的交互作用對多酚氧化酶活性影響顯著。回歸方程模型的方差分析結果與響應面圖反映的各因素之間交互作用結果一致。

圖5 各因素交互作用對多酚氧化酶活性影響的響應面圖

3.2.4.3 總黃酮含量

由圖6可知，AC的等高線圖為橢圓形，AC交互作用顯著。回歸方程模型的方差分析結果與響應面圖反映的各因素之間交互作用結果一致。

圖6 各因素交互作用對總黃酮含量影響的響應面圖

3.3 響應面法優化涂膜條件的預測及驗證

根據所得響應面數據，對上述3個多元回歸方程用Design-Expert 8.0.6軟件擬合優化，得到最優的涂膜條件：（1）乳酸菌素0.008 976%、茶多酚1.496%、殼寡糖1.602 5%，預測多酚氧化酶的氧化活性21.330 U；（2）乳酸菌素0.014 3%、茶多酚1.534 5%、殼寡糖1.5%，失重率4.518%；（3）乳酸菌素0.010 75%、茶多酚1.630 5%、殼寡糖1.573%，總黃酮6.155%。為便于實際試驗的可操作性，修整其工藝：乳酸菌素0.01%，茶多酚1.5%，殼寡糖1.5%，在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，失重率4.62%，多酚氧化酶活性19.75 U、總黃酮5.98%，與預測值相差不大，表明該配方可行。

4 結論

試驗對鮮切蘋果涂膜保鮮進行了研究，采用單因素試驗及響應面試驗，確定了復合涂膜的最佳配方：乳酸菌素0.01%，茶多酚1.5%，殼寡糖1.5%。此優化配方條件降低了失重率和多酚氧化酶活性、提高了總黃酮含量，復合涂膜處理對鮮切蘋果具有更好的保鮮效果。此研究結果將為鮮切蘋果的貯藏保鮮提供理論依據和技術支撐，復合涂膜在鮮切果蔬保鮮方面具有廣闊的應用前景。