磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物輔助改善記憶動物試驗

許文慧，張志超，黃遠英，殷光玲

廣東佰悅網(wǎng)絡科技有限公司（廣州 510663）

兒童時期是認知發(fā)展的關鍵時期，研究表明改善營養(yǎng)和最佳大腦功能之間存在聯(lián)系，營養(yǎng)素在細胞增殖、DNA合成、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和激素代謝中起關鍵作用，在大腦發(fā)育的關鍵時期缺乏營養(yǎng)將會對智力發(fā)展產(chǎn)生持久的影響[1-3]。與營養(yǎng)不均衡的學生相比，營養(yǎng)均衡的學生在考試中表現(xiàn)得更好[4]。

牛磺酸可以促進人腦神經(jīng)細胞的增殖、分化和成熟[5]。研究表明，補充牛磺酸可以改善學習和記憶能力[6-7]。磷脂酰絲氨酸（PS）在人體具有很高的生物利用度，可以通過血腦屏障[8]。膳食補充PS可以影響人們的記憶力和注意力，從而影響學習能力[9]。α-亞麻酸（ALA）是一種人體不能合成的必需脂肪酸，膳食中缺乏ALA會導致大腦中DHA的水平有所下降，影響相關腦功能[10]。有證據(jù)表明從ALA合成的DHA足以維持大腦功能[11]。兒童補充B族維生素如維生素B1和維生素B6可以改善認知能力[12]。

中國4~12歲兒童的父母中有52%會購買對兒童智力發(fā)展有益的產(chǎn)品[13]。開發(fā)復配磷脂酰絲氨酸、牛磺酸和α-亞麻酸的保健食品可能對改善少年兒童的學習記憶具有重大意義。此次研究擬通過動物試食試驗，探究磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物產(chǎn)品輔助改善記憶的功能效果，為其合理利用及功能因子的有效用量提供科學支持。

1 材料與方法

1.1 受試樣品及試驗動物

磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物（磷脂酰絲氨酸30 mg/d、牛磺酸134 mg/d、α-亞麻酸254.4 mg/d，湯臣倍健股份有限公司）；植物油（遼寧晟麥實業(yè)股份有限公司）。

試驗動物為SPF級雄性昆明種小鼠，共240只，體重為18~22 g[長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2009-0012]；飼料（長沙市天勤生物技術有限公司）。試驗條件為屏障環(huán)境，溫度22~24 ℃，濕度52%~56%。

1.2 儀器與設備

ZH-1小鼠水迷宮儀、ZH-600小鼠避暗儀、YLS-3TB小鼠跳臺儀（安徽正華生物設備有限公司）。

2 方法

2.1 劑量選擇與受試物給予方式

每個試驗中，分別將試驗小鼠按體重隨機分成3個劑量組和1個對照組，每組10只。兒童體重按30 kg計算，磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物折合劑量為0.033 3 g/（kg·bw），參考《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗方法中關于受試樣品劑量的要求[14]，按人體推薦用量的5，10和30倍確定小鼠受試樣品的低、中、高劑量，分別為0.167，0.333和1.000 g/（kg·bw），3個劑量組受試液配制時分別取磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物1.67，3.33和10.00 g加植物油至100 mL，對照組給予等體積的植物油，每天對小鼠灌胃一次，灌胃體積為0.1 mL/（10 g·bw），連續(xù)灌胃30 d。

2.2 試驗方法

2.3 跳臺試驗

分別設低劑量組[0.167 g/（kg·bw）]、中劑量組[0.333 g/（kg·bw）]、高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]和對照組，每組10只小鼠，對其連續(xù)灌胃30 d后進行跳臺試驗，具體試驗方法參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗方法[14]。

2.4 避暗試驗

小鼠的選擇、分組、給受試物的劑量、方式和時間均同跳臺試驗，對小鼠連續(xù)灌胃30 d后開始避暗試驗，具體試驗方法參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗方法[14]。

2.5 水迷宮試驗

小鼠的選擇、分組、給受試物的劑量、方式和時間均同跳臺試驗，對小鼠連續(xù)灌胃30 d后開始水迷宮試驗，具體試驗方法參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗方法[14]。

2.6 統(tǒng)計方法

跳臺試驗中的潛伏期、避暗試驗中的潛伏期、水迷宮試驗中到達終點的時間均屬計量資料，對其進行方差齊性檢驗。若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異用Dunnett法進行多個劑量組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較；若方差不齊，則對原始數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。跳臺試驗中的錯誤次數(shù)和跳下平臺的動物數(shù)、避暗試驗中的錯誤次數(shù)和錯誤動物數(shù)、水迷宮試驗中錯誤次數(shù)和到達終點的動物數(shù)均為計數(shù)資料，用χ2檢驗，四格表總例數(shù)小于40，或總例數(shù)大于或等于40但出現(xiàn)理論數(shù)小于或等于1時，改用確切概率法。P＜0.05表示與對照組比較有顯著性差異，P＜0.01表示與對照組比較有極顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物對小鼠體重的影響試驗

期間，分別給予小鼠不同劑量的受試物，經(jīng)口連續(xù)灌胃30 d，各組小鼠無異常表現(xiàn)，且初始體重與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），末期體重與對照組比較也無顯著性差異（P＞0.05），兩次試驗結(jié)論一致，說明食用受試物不會對小鼠體重產(chǎn)生不良影響，具體見表1。

表1 磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物對小鼠體重的影響

3.2 磷脂酰絲氨酸復合物對小鼠跳臺試驗的影響

從表2可見，兩次試驗中，潛伏期隨受試物劑量的增加而增加，高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]的潛伏期最長，且與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗中，各劑量組小鼠錯誤次數(shù)隨受試物劑量的增加而減少，高劑量組的錯誤次數(shù)最少，且與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗中，各劑量組小鼠跳下平臺的動物數(shù)與對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），但錯誤動物數(shù)隨劑量的增加而減少，高劑量組錯誤動物數(shù)最少。結(jié)果表明，高劑量組的小鼠，學習記憶能力明顯改善，兩次跳臺試驗結(jié)果均為陽性。

表2 小鼠跳臺試驗結(jié)果

從表3可見，兩次跳臺消退試驗中，各劑量組小鼠跳下平臺的潛伏期、錯誤次數(shù)、跳下平臺的動物數(shù)與對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05），但高劑量組的潛伏期最長，錯誤次數(shù)最少，且錯誤動物數(shù)最少，消退試驗對小鼠學習記憶的影響隨劑量的增加而減小，兩次消退試驗結(jié)論一致。

表3 小鼠跳臺消退試驗結(jié)果

3.3 磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物對小鼠避暗試驗的影響

從表4可見，兩次試驗中，各劑量組小鼠進入暗室潛伏期與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），但隨受試物劑量的增加而延長，且高劑量組的潛伏期是最長的。兩次試驗中，各劑量組錯誤次數(shù)與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），但隨劑量的增加而減少，且高劑量組的錯誤次數(shù)最少。兩次試驗中，各劑量組進入暗室的動物數(shù)與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），但錯誤動物數(shù)隨受試物劑量的增加而減少，且高劑量組的錯誤動物數(shù)最少。兩次避暗試驗結(jié)果均為陰性，但從試驗數(shù)據(jù)隨受試物劑量增加而發(fā)生的規(guī)律變化來看，仍能在一定程度上解釋受試物對小鼠學習記憶能力的改善。

表4 小鼠避暗試驗結(jié)果

從表5可見，兩次避暗消退試驗中，各劑量組小鼠進入暗室的潛伏期、錯誤次數(shù)、進入暗室的動物數(shù)與對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05），但高劑量組的潛伏期最長，錯誤次數(shù)最少，且進入暗室的動物數(shù)最少，消退試驗對小鼠學習記憶的影響隨受試物劑量的增加而減小，兩次消退試驗結(jié)論一致。

表5 小鼠避暗消退試驗結(jié)果

3.4 磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物對小鼠水迷宮試驗的影響

從表6可見，兩次試驗中，到達終點時間隨劑量的增加而減少，高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]小鼠到達終點的時間最短，且與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗中，到達終點前錯誤次數(shù)隨受試物劑量的增加而減少，高劑量組小鼠到達終點前的錯誤次數(shù)最少，且與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。兩次試驗中，高劑量組2 min內(nèi)到達終點的動物數(shù)隨受試物劑量的增加而增加，高劑量組小鼠2 min內(nèi)到達終點的動物數(shù)最多，且與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，高劑量組的小鼠，學習記憶能力明顯改善，兩次水迷宮試驗結(jié)果均為陽性。

表6 小鼠水迷宮試驗結(jié)果

從表7可見，兩次水迷宮消退試驗中，各劑量組小鼠到達終點時間、到達終點前的錯誤次數(shù)和2 min內(nèi)到達終點動物數(shù)與對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），但高劑量組到達終點時間最短，到達終點前錯誤次數(shù)最少，且2 min內(nèi)到達終點的動物數(shù)最多，消退試驗對小鼠學習記憶的影響隨受試物劑量的增加而減小，兩次消退試驗結(jié)論一致。

表7 小鼠水迷宮消退試驗結(jié)果

4 結(jié)論

在此研究中，以牛磺酸、磷脂酰絲氨酸和亞麻籽油制備得到的磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物為受試樣品，開展小鼠試驗，驗證其輔助改善記憶的功能。以低劑量組[0.167 g/（kg·bw）]、中劑量組[0.333 g/（kg·bw）]、高劑量組[1.000 g/（kg·bw）]的受試樣品連續(xù)給小鼠灌胃30 d，同時設置空白對照組，經(jīng)跳臺試驗、避暗試驗、水迷宮試驗三項試驗，其中水迷宮和跳臺試驗結(jié)果均為陽性，且重復試驗結(jié)論一致。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）第二部分第五節(jié)輔助改善記憶功能檢驗方法的要求，為輔助改善記憶功能而開展的動物試驗中需滿足任二項試驗結(jié)果為陽性，且重復試驗結(jié)果一致，可以判定該受試樣品具有輔助改善記憶的功能[14]。由此判定此試驗中使用的受試物磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物具有輔助改善記憶的功能。磷脂酰絲氨酸牛磺酸復合物推薦人體日服劑量1 g/d，相當于攝入磷脂酰絲氨酸30 mg/d、牛磺酸134 mg/d、α-亞麻酸254.4 mg/d。

2022年3月，教育部發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國處于幼兒園、小學及中學階段的在校學齡兒童人數(shù)規(guī)模近2.5億，2021年“三孩”政策正式出臺助力生育率提升，學習是兒童日常生活中非常重要的一部分，在兒童的學習狀態(tài)方面，專注力差和記憶力差等問題往往是家長的教育痛點所在，因此有輔助改善記憶功能的營養(yǎng)保健食品需求極大。現(xiàn)已確認，牛磺酸對人腦細胞具有促增殖的作用，可以促進神經(jīng)細胞的分化與成熟[15]。神經(jīng)元細胞膜內(nèi)高濃度的PS對促進神經(jīng)元存活具有重要作用，有研究認為PS可能是通過促進乙酰膽堿的釋放和增加腦內(nèi)DHA的含量來維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，從而改善學習記憶能力[16]。ALA作為DHA的前體物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)過增長碳鏈和去飽和可以轉(zhuǎn)化成DHA，DHA有助于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，嬰幼兒時期如果缺乏DHA就會抑制腦細胞的充分生長和樹突的形成，表現(xiàn)為幼兒的智力低下，足量的DHA有助于提高學習記憶能力[8]。相較魚油來源的DHA來說，其前體ALA的補充更為安全[17]。此研究所用的牛磺酸、磷脂酰絲氨酸和α-亞麻酸已經(jīng)被廣泛動物及臨床研究證實，可促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，有助于提高學習記憶能力，因此三者的組合物產(chǎn)品具有良好的發(fā)展前景。相信隨著科研水平的不斷進步，未來會有更多輔助改善記憶功能的原料和產(chǎn)品被開發(fā)，為消費者提供更多選擇。